透明质酸改性PHBV组织工程纳米纤维支架的研究*

刘海蓉，黄继英，周征，胡薏冰，李永生，3，邹鹏，戴瑶，3

(1.湖南大学 材料科学与工程学院，湖南 长沙 410082； 2.湖南大学 生物学院，湖南 长沙 410082；3.喷射沉积技术及应用湖南省重点实验室，湖南 长沙 410082； 4.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410013)



透明质酸改性PHBV组织工程纳米纤维支架的研究*

刘海蓉1，3†，黄继英1，周征2，胡薏冰4，李永生1，3，邹鹏1，戴瑶1，3

(1.湖南大学 材料科学与工程学院，湖南 长沙 410082； 2.湖南大学 生物学院，湖南 长沙 410082；3.喷射沉积技术及应用湖南省重点实验室，湖南 长沙 410082； 4.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410013)

组织工程支架材料表面性质对细胞的黏附起着重要作用，进而影响细胞的增殖、分化等一系列生长过程.本研究采用天然生物大分子透明质酸(hyaluronic acid ，HA)对聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，PHBV)进行表面修饰以提高材料的表面生物活性.首先通过静电纺丝法制备PHBV纳米纤维支架，利用1,6-己二胺胺解在PHBV表面引入自由胺基，并以此为反应活性位点在水溶性的碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺缩合剂体系中将透明质酸固定接枝在PHBV表面.SEM结果表明，静电纺丝制备的PHBV纳米纤维支架表面平滑程度高，纤维直径分布较均匀，且没有串珠；FTIR证明1，6-己二胺改性及透明质酸接枝改性PHBV纳米纤维支架材料均成功实现；茚三酮法表明PHBV表面胺基密度随胺解时间增加而增大，在胺解约50 min时达到最大值；水接触角法表明固定接枝透明质酸后，表面亲水性明显改善；细胞实验表明透明质酸改性的PHBV纳米纤维支架可显著促进软骨细胞的体外增殖.综上所述，透明质酸改性的PHBV纳米纤维支架可望应用于软骨组织工程领域.

透明质酸；PHBV纳米纤维支架；表面改性；亲水性；生物相容性

聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(PHBV)是原核微生物合成的天然高分子共聚物，在生物体内可以完全降解，最终产物为二氧化碳和水，具有良好的生物相容性、生物可降解性、热稳定性和力学性能，因此作为支架材料广泛应用于组织工程领域[1-3].然而，PHBV亲水性较差，表面缺少细胞可识别的反应位点，严重影响了细胞的黏附、生长和增殖[4-5].材料表面修饰是提高材料对细胞亲和性的有效方法[6-8].WANG等[9]将胶原固定接枝在PHBV膜表面，以改善PHBV表面亲水性，实验结果表明固定胶原分子后，材料亲水性明显改善，通过培养骨髓基质干细胞发现，改性的PHBV膜材料能明显促进干细胞的黏附、迁移和增殖.Yu等[10]通过将壳聚糖和硫酸软骨素共价固定在PHBV膜表面，发现改性后的PHBV生物材料亲水性和生物相容性明显改善，在材料上培养成纤维细胞结果表明，细胞在改性的PHBV膜上增殖活性大大提高.

透明质酸是细胞外基质的主要组成成分，是重要的生理活性物质，具有良好的生物相容性和特殊的生理功能，其不具抗原性、不致敏、不发生免疫反应，并且能被生物体内的透明质酸酶降解，代谢过程本身在生物体中天然存在，不会产生任何有害的代谢产物[11-13].更为重要的是，透明质酸能够被特定的细胞受体识别，从而调控细胞的黏附、生长和分化等一系列生理行为[14-16].纳米纤维支架材料由于具有较高的比表面积，很好地模拟了细胞在体内的纳米/次微米级别的胶原纤维束结构，从而在组织工程领域得到了越来越广泛的应用[17-18].静电纺丝技术能够连续制备纳米级或次微米级超细纤维，其制备的支架具有独特的微观结构和适当的力学性能，可以模拟天然细胞外基质的纳米纤维网状结构[19-20].本文采用静电纺丝法制备了PHBV纳米纤维支架，并且在充分了解PHBV酯基聚合物化学结构特点的基础上，采用二元胺解酯基法[21-22]在PHBV材料表面引入自由胺基，进而以自由胺基为反应活性位点，将透明质酸生物大分子固定接枝在PHBV静电纺丝纳米纤维支架上，通过在改性纳米纤维支架材料上种植羊关节软骨细胞检测改性支架材料的细胞亲和性，以此评估改性PHBV纳米纤维支架在软骨组织工程中的应用.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

PHBV(Mw=300 000，3%HV)，宁波天安生物材料有限公司，结构式见图1(a)；透明质酸，分析纯，北京索莱宝科技有限公司，结构式见图1(b)；N，N-二甲基甲酰胺，1，6-己二胺，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；氯仿(CHCl3)，分析纯，衡阳市凯信化工试剂有限公司；异丙醇，分析纯，天津市恒兴化学试剂有限公司；茚三酮，分析纯，上海山浦化工有限公司；无水乙醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；碳化二亚胺(EDAC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，分析纯，上海阿拉丁生化科技有限公司；DMEM/HIGH GLUCOS培养基，胎牛血清，Gibco；双抗(青霉素和链霉素)，胰蛋白酶，酶标板，北京鼎国生物技术有限公司；AlamarBlue，Invitrogen；细胞培养皿，24孔细胞培养板，Greiner bio-one.

图1 PHBV(a)和透明质酸(b)的分子结构式Fig. 1 Structure of PHBV (a)and hyaluronic acid (b)

电子天平，FA1104，上海天平仪器厂；超声波清洗机，EQ5200，昆山市超声仪器有限公司；万能倒置显微镜，IX2-1LL100，OLYMPUS；冷冻离心机，MICRO 17R,Thermo；单推注射泵，LSP01-1A，保定兰格恒流泵有限公司；紫外可见分光光度计，UV-2600，Unico；傅里叶红外光谱仪，Nexus，Thermo Nicolet；机械分析仪(TMA)，SS7300，日本精工；视频光学水接触角测量仪，DSA100，德国KRUSS公司；酶标仪，MK3，Thermo；环境扫描电子显微镜，Quata200，USA；生物安全柜，HF-1200，中国力新发展有限公司；CO2培养箱，BB15，Thermo.

1.2 实验过程

1.2.1 PHBV静电纺丝纳米纤维支架的制备

将PHBV粉末以5%(w/v)比例加入氯仿溶液，在60 ℃超声溶解10 min，然后加入10%(v/v)N,N-二甲基甲酰胺，将制得的PHBV溶液转移到玻璃注射器，置于注射泵机上.注射泵机上设置聚合物溶液流速为3.5 mL/h，注射器针头到接收板距离为15 cm，静电场电压为15 kV.在电场力作用下，聚合物溶液克服表面张力喷射出去，形成细流，随着溶剂挥发，形成纤维聚集在接收板上，从而得到PHBV纳米纤维支架.制备好的PHBV纳米纤维支架置于空气中24 h，使残余的氯仿溶剂挥发完全.

1.2.2 PHBV纳米纤维支架表面引入自由胺基

二元胺中的一个胺基与含酯基聚合物材料上的酯基在一定条件下可以发生胺解反应生成酰胺键，同时保留另一胺基的活性，这些自由胺基的存在不仅能提高聚酯类材料的亲水性，中和此类聚合物在降解过程中产生的局部酸性，而且自由胺基所带来的正电性还能促进细胞与材料的黏附和铺展，从而为细胞的生长提供一个友好的界面；另一方面，材料表面自由胺基的存在还提供了使聚合物进一步与其它生物分子反应的活性位点，胺解反应过程见图2.

将静电纺丝制得的PHBV纳米纤维支架裁成直径为14 mm，厚度为1 mm的圆柱形样品，将这些样品浸入乙醇/水(1/1，v/v)混合溶剂中浸泡30 min，以去除表面粘附的油脂和其它杂质.用水充分漂洗后，浸入1,6-己二胺/异丙醇溶液中，40 ℃下反应一定时间，反应完毕，用双重蒸馏水将样品冲洗三遍，然后将样品浸没于大量双重蒸馏水中漂洗24 h，期间每隔4 h 换一次双重蒸馏水，以除去表面未反应的己二胺，然后放入30 ℃干燥箱中干燥，即可得到引入自由胺基的PHBV纳米纤维支架(PHBV-NH2).

图2 1,6-己二胺及透明质酸改性PHBV流程图Fig. 2 Schematic synthesis of 1，6-hexanediamine and hyaluronic acid modified PHBV

1.2.3 胺解PHBV纳米纤维支架表面固定接枝透明质酸

为进一步提高材料的亲水性和表面活性，在引入了自由胺基的条件下将透明质酸固定在PHBV纳米纤维支架表面.准确量取45 mL双重蒸馏水于50 mL离心管中，分别加入5 mg/mL透明质酸、6 mg/mL EDAC，8 mg/mL NHS，制成透明质酸活化体系溶液，4 ℃条件下活化36 h后，取出活化溶液，分成15 mL各三份，加入1,6-己二胺胺解的PHBV纳米纤维支架，室温下反应36 h.用大量双重蒸馏水洗净透明质酸改性的PHBV纳米纤维表面的EDAC/NHS溶液，常温下烘干，得到胺解40 min，60 min,80 min接枝HA的PHBV纳米纤维支架，为便于区分，分别命名为PHBV-H1，PHBV-H2，PHBV-H3，反应流程图如图2所示.

1.2.4 软骨细胞与改性PHBV纳米纤维支架材料共培养

在材料上培养软骨细胞前需要对材料进行预处理，主要是指对材料进行灭菌消毒防止外界带入细菌影响细胞的生长，以及进行培养液的预浸泡平衡细胞的生存环境.将经75%乙醇充分灭菌的PHBV及改性PHBV纳米纤维支架放入24孔细胞培养板，加入适量新鲜培养液预浸泡，在37 ℃，5% CO2细胞培养箱中静置24 h.取出经过预浸泡的纳米纤维支架材料，除去浸泡液后备用.当软骨细胞长满整个培养皿时，用胰蛋白酶消化使细胞脱壁后及时加入适量新鲜培养液终止消化，吹打均匀制成细胞悬浮液.利用血细胞计数板对细胞进行计数，根据接种数量稀释成相应的浓度后，将适量细胞悬浮液滴加到材料中(每个材料试样接种1×104个细胞)，将其放于细胞培养箱中静置4～6 h，使细胞黏附在材料上后，再将含有细胞的材料转移到新的培养板上，加入适量的新鲜培养液在细胞培养箱中继续培养.

2 结果与讨论

2.1 PHBV纳米纤维支架表面形貌

PHBV纳米纤维支架和透明质酸改性的PHBV纳米纤维支架的形貌如图3所示.从图中可观察到纳米纤维支架材料是由不同取向的纤维堆积形成的多孔网状结构，纤维孔隙相互贯通，纤维表面平滑程度高，样品纤维直径分布较均匀，且没有串珠.选取五张图片，用Image J软件量取100根纤维，得到纤维直径大小分布图(图3(c)(d)).测量统计结果发现，PHBV纳米纤维的平均直径为723 ± 38 nm，改性的PHBV纳米纤维平均直径为756 ± 68 nm.从数据结果看，改性的PHBV纳米纤维直径略有增加，这是因为透明质酸大分子固定接枝在PHBV表面，随机占领了PHBV纳米纤维表面一定空间，从而使纤维直径略微增大，但在统计学分析上，与PHBV纳米纤维直径大小无显著差异，说明接枝透明质酸分子并没有影响PHBV纳米纤维的形貌.

2.2 茚三酮法测定PHBV材料表面胺基密度

为检测材料表面胺基密度随反应时间的变化，本研究采用茚三酮法定量分析胺解材料表面的胺基密度.将胺解纳米纤维支架在茚三酮/乙醇溶液中浸泡1 min，然后直接放入洁净试管中，在80 ℃水浴中加热15 min，以加速胺基与茚三酮的反应.待材料表面呈现蓝紫色时往试管中加3 mL氯仿以溶解此材料，另加3 mL异丙醇以稳定反应所产生的蓝紫色，然后在紫外-可见分光光度计上测吸光度，所测吸光度与标准曲线对照，即可得到纳米纤维支架材料表面的胺基密度.

图3 PHBV纤维(a)(c)和HA改性的PHBV纤维(b)(d)的电镜图及纤维直径分布图 (p>0.05)Fig. 3 SEM images and fiber diameter distribution of PHBV fibers (a)(c)and HA modified PHBV fibers (b)(d)，respectively (p>0.05)

标准曲线的绘制：将己知浓度的1,6-己二胺溶液(以异丙醇∶氯仿=1∶1作溶剂)用茚三酮显色反应后，使用多波长紫外分光光度计在1,6-己二胺最大吸收峰位置563 nm下测试其吸光度.以吸光度对1,6-己二胺溶液官能团胺基(-NH2)的摩尔浓度作图，即可得到1,6-己二胺胺基(-NH2)摩尔浓度与吸光度对应的标准曲线，如图4(a)所示.

在10%(w/v)1,6-己二胺/异丙醇浓度下，表面胺基密度随胺解反应时间的变化曲线如图4(b)所示.由图可知，表面胺基密度先是随胺解反应时间的增加而增大，在约50 min时达到最大值，而后有所下降.这是由于胺解在本质上会导致表层聚合物的部分降解，因此，当胺解达到一定程度时，必将导致聚合物表层的溶解或脱落，造成胺基密度下降.此外，长时间的胺解将导致聚合物材料机械性能的下降甚至材料的整体崩解，在胺解反应时间超过80 min时，材料发生明显脆化，因此制样时胺解时间均不超过80 min.

图4 胺基与茚三酮反应物的紫外可见光谱标准曲线和胺解的PHBV表面胺基密度随胺解时间的变化曲线Fig. 4 The calibration curve of UV-vis absorbance of ninhydrin-NH2 compound at 563 nm (a)and the NH2 group density on the aminolyzed PHBV surface as a function of aminolysis time (b)

2.3 FTIR化学结构分析

通过傅里叶变换红外光谱仪分别对PHBV样品、1,6-己二胺改性PHBV样品和透明质酸改性的PHBV样品粉末进行红外分析，结果如图5所示.从FTIR分析谱图上可以看出，对于PHBV分子，红外谱图中的1 725 cm-1为PHBV中典型的羰基酯(C=O)伸缩振动峰，2 985 cm-1，2 925 cm-1，2 890 cm-1分别为-CH3，-CH2，-CH的反对称伸缩振动峰.相比于未改性的PHBV样品，1,6-己二胺改性的PHBV在1 725 cm-1处的吸收峰减弱，这是由于1,6-己二胺与PHBV主链上的酯基键发生胺解反应，使得酯基键数量减小.而在3 441 cm-1处出现的新吸收峰，对应的是胺基上N—H的伸缩振动，1 460 cm-1处对应的是生成的C—N键的伸缩振动.对于透明质酸改性的PHBV红外谱图，在3 700～3 500 cm-1波段出现了较强的吸收峰，这对应的是透明质酸上自由羟基和羧基的O—H键伸缩振动吸收峰，另外，在3 400～2 800 cm-1波段出现宽且强的吸收峰，这对应的是透明质酸酰胺键的N—H伸缩振动，而在1 288 cm-1处的吸收峰相较于1,6-己二胺改性的PHBV有所减弱，这是透明质酸接枝改性发生酰胺化反应，消耗了PHBV表面引入的部分胺基所致.这些结果表明，1,6-己二胺改性及透明质酸改性PHBV纤维支架均成功实现.

图5 HA接枝改性PHBV的红外光谱对比图：PHBV (a)，1，6-己二胺改性PHBV (b)，HA改性PHBV (c)Fig. 5 FTIR spectra of PHBV (a)，1，6-hexanediamine modified PHBV (b)and hyaluronic acid modified PHBV (c)

2.4 表面亲水性检测

细胞直接也是最先接触并发生作用的是材料表面，因此，提高材料表面的亲水性对促进细胞的黏附至关重要[23-24].一般来讲，材料亲水性好时，与水的亲和力强，易被水润湿，其水接触角相应会比较小，反之，水接触角会比较大.本研究采用DSA100型号视频光学水接触角测量仪对材料的亲水性接触角进行测量.图6(a)是1,6-己二胺改性及透明质酸改性PHBV材料表面的水接触角随胺解反应时间的变化曲线.由图可知，经过胺解反应后，PHBV表面引入了一定量的亲水性基团胺基，胺解改性样品(PHBV-NH2)的水接触角随胺解时间的增加而减小，但减小幅度较小，这可能是因为亲水性的胺基在疏水的空气中不易伸展，而且为了降低分子表面能，可能会隐藏在疏水的分子链中，因此在测接触角时，胺基的亲水性并未能完全体现出来.此外，胺解的PHBV样品表面水接触角并不与表面胺基密度成比例关系，胺解时间超过50 min的PHBV-NH2材料亲水性比所测胺基密度最大的50 min胺解时间的材料要好，这是因为接触角除了与表面亲水基团有关，也与材料表面形貌有关，胺解时间越长，PHBV材料表层聚合物分解得越多，材料表面变粗糙，从而使水接触角减小.

图6 不同改性PHBV样品表面水接触角随胺解时间的变化曲线和透明质酸改性 PHBV的表面水滴接触图(1,6-己二胺浓度为10%(w/v))Fig. 6 The influence of aminolysis time on the water contact angle of treated PHBV fibrous scaffolds and the images of water drop on PHBV (a)，PHBV-H1 (b)，PHBV-H2 (c)，PHBV-H3 (d)at 10%(w/v)1,6-hexanediamine concentration，respectively

由胺基密度测定结果可知(图4(b))，胺解时间在40～80 min之间的PHBV表面胺基密度较大，且为保证样品之间的差异性，本实验采用胺解40 min，60 min，80 min的PHBV纳米纤维支架固定接枝透明质酸大分子，为方便区分，分别命名为PHBV-H1，PHBV-H2，PHBV-H3，进而研究不同接枝率梯度的透明质酸改性PHBV纳米纤维支架对软骨细胞体外增殖的效果.图6(b)是透明质酸改性的PHBV纳米纤维支架材料的水接触角照片，由图可以看出，PHBV材料具有高分子的疏水特性，其水接触角比较大，约为122°，亲水性较差；随着胺解时间的增加，材料与水的润湿性提高，表现为水滴在膜材料上更加容易铺展开.固定接枝透明质酸后，改性的PHBV纳米纤维支架的水接触角分别下降到了109°，101°和 93°，亲水性明显改善，并且接枝了透明质酸的PHBV纳米纤维支架材料的亲水性也明显优于1，6-己二胺改性的PHBV纳米纤维支架材料(图6(a))，这主要是由于生物活性大分子透明质酸具有优良的亲水性，固定接枝至PHBV高分子主链上后可以增加对水的吸附能力，改善高分子基体的亲水性.

2.5 细胞在材料上的生长形貌

软骨细胞与支架材料接触后通常要经历黏附、迁移和增殖等几个阶段，其中黏附是细胞与材料相互作用的第一个阶段[25-26].图7为软骨细胞在HA改性的PHBV纳米纤维支架材料上培养1 d和7 d的电镜图片，由图7(a)～(d)可知，细胞在PHBV纳米纤维支架材料上黏附良好，呈多边形铺展生长，且逐渐生出伪足与材料表面紧密的贴合在一起.这可能是由于静电纺丝纳米纤维支架可以模拟细胞外基质天然的纳米级纤维束结构，因此有利于细胞的黏附行为.

培养至第七天，由图7(e)～(f)可观察到，软骨细胞在HA改性的PHBV纳米纤维支架材料表面形态正常，伸出扁状伪足相互连接或黏附在材料表面，同时分泌出许多细胞外基质(ECM)覆盖在细胞周围的纤维支架材料上，细胞间紧密生长；PHBV纳米纤维支架材料上细胞分泌的ECM数量相对较少(图7(e)).此外由图7(e)～(f)可看到，在软骨细胞生长的周围出现纤维拉断的现象，这可能是由于软骨细胞与纺丝纤维黏附力强，随着细胞活动舒展，细胞间黏附的纤维发生扯断.以上实验结果表明，采用天然生物大分子透明质酸改性PHBV纳米纤维支架，可以改善PHBV基体的表面性质，促进软骨细胞分泌细胞外基质，从而可促使软骨细胞在改性的PHBV纳米纤维支架材料上的增殖.

图7 软骨细胞在HA改性的PHBV纳米纤维支架上培养1天和7天的SEM图，PHBV (a)(e)， PHBV-H1 (b)(f)，PHBV-H2 (c)(g) and PHBV-H3 (d)(h)Fig.7 SEM micrographs of chondrocytes cultured on PHBV (a)(e)，PHBV-H1 (b)(f)， PHBV-H2 (c)(g)and PHBV-H3 (d)(h)for 1d and 7d，respectively

2.6 Alamar Blue法检测软骨细胞的增殖活性

为定量表征软骨细胞在透明质酸改性的PHBV纳米纤维支架上的增殖活性，本研究采用特异性强、灵敏度高、重复性好的Alamar Blue手段检测软骨细胞在支架上的增殖率[27-29].图8为软骨细胞在不同胺解时间的透明质酸改性PHBV纳米纤维支架的Alamar Blue检测结果.由图可知，细胞培养至第七天，与纯PHBV纳米纤维支架5.4倍的增殖率相比，PHBV-H1，PHBV-H2和PHBV-H3分别达到了6.6倍、7.6倍、6.1倍，增殖率有明显提高.其中PHBV-H2纤维支架对软骨细胞体外增殖的促进作用最为显著，在一周的细胞培养过程中基本保持指数式增长，这说明透明质酸作为软骨细胞外基质的重要组成成分，对调控软骨细胞的黏附、生长及增殖起着重要的作用.实验结果表明，在PHBV材料表面引入透明质酸生物大分子，可以明显改善材料的生物相容性，提高细胞的增殖活性.

3 结 论

本文以天然可降解的PHBV作为高分子基体，采用静电纺丝法制备PHBV纳米纤维支架，利用1,6-己二胺反应引入自由胺基，并以此为反应位点，在PHBV纳米纤维支架材料表面固定接枝天然生物大分子透明质酸，以提高PHBV纳米纤维支架表面亲水性并提供细胞可识别的黏附位点，从而提高软骨细胞在纳米纤维支架材料上的增殖活性.FTIR检测表明1,6-己二胺改性及透明质酸固定接枝改性PHBV材料均成功实现.茚三酮法定量测定材料表面胺基密度结果表明，在胺解时间达到50 min时，表面胺基密度最大.SEM图片表明静电纺丝法制备的PHBV纳米纤维直径分布较均匀，纤维表面平滑程度高，且没有串珠，纤维堆积形成的孔隙相互贯通.水接触角测量结果表明，PHBV材料表面亲水性随胺解时间增加而提高，固定接枝透明质酸生物分子后，PHBV材料的水接触角从改性前的122°分别下降到了109°，101°和93°，材料亲水性明显改善.体外细胞培养实验结果表明，在PHBV材料表面引入透明质酸生物大分子，可以改善PHBV基体的表面性能，促进软骨细胞黏附生长并分泌许多细胞外基质，进而提高细胞在PHBV纳米纤维支架材料上的增殖活性.

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Surface Modification of PHBV Tissue Engineering NanofibrousScaffolds with Hyaluronic Acid

LIU Hairong1，3†，HUANG Jiying1，ZHOU Zheng2，HU Yibing4，LI Yongsheng1，3，ZOU Peng1，DAI Yao1，3

(1.College of Materials Science and Engineering，Hunan University，Changsha 410082，China;2.College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China;3.Hunan Province Key Laboratory for Spray Deposition Technology and Application，Hunan University，Changsha 410082，China;4.Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha 410013，China)

Surface properties of tissue engineering scaffold play important roles in cell adhesion and other biological processes such as cell proliferation,differentiation. In this study,the surface modification of Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) was performed in order to improve the biological activity of material surface. PHBV nanofibrous scaffold was firstly made by electrostatic spinning method,introducing free amino groups in the PHBV surface through 1,6-hexanediamine,which provided reaction sites for the further immobilization of hyaluronic acid (HA) macromolecules. The morphology observed by SEM showed that PHBV nanofibrous scaffolds prepared by electrostatic spinning method have smooth surfaces without obvious beads defects and their fiber diameters uniformly distribute. FTIR analysis proved that 1,6-hexanediamine and hyaluronic acid modified PHBV fibrous scaffolds were successfully achieved. The ninhydrin determination results showed that the surface amine group density,which increased with the extending of aminolysis time,reached its maximum at 50 minutes. Furthermore,there is no significant difference on the morphology of the scaffolds before and after modification by statistic comparison. The water contact angle significantly decreased after the immobilization of hyaluronic acid,indicating that the hydrophilicity was obviously improved after surface modification with the hydrophilic natural biological macromolecules. The Alamar Blue assay manifested that hyaluronic acid modified PHBV nanofibrous scaffolds could significantly promote the chondrocytes proliferationinvitro. Therefore,the hyaluronic acid modified PHBV nanofibrous scaffolds are potential for application in cartilage tissue engineering.

hyaluronic acid;PHBV nanofibrous scaffolds;surface modification;hydrophilicity;biocompatibility

1674-2974(2017)06-0087-09

10.16339/j.cnki.hdxbzkb.2017.06.015

2016-08-11

教育部新世纪优秀人才(NECT-12-0170)；湖南省自然科学基金(2016JJ2023)，Natural Science Foundation of Hunan Province(2016JJ2023)；湖南省研究生创新基地(2014-2017)；湖南大学交叉学科研究资助项目(2014JCA09)

刘海蓉(1971-)，女，湖南衡阳人，湖南大学副教授，博士†通讯联系人，E-mail：liuhairong@hnu.edu.cn

O632；O636

A