丁烯二酸单酯化-β-环糊精修饰的磁性纳米颗粒制备及性能研究

陈鹏飞，宋 航，李福林，唐梦雨，周 鲁

（四川大学化学工程学院制药与生物工程系，四川 成都 610065）

丁烯二酸单酯化-β-环糊精修饰的磁性纳米颗粒制备及性能研究

陈鹏飞，宋 航，李福林，唐梦雨，周 鲁

（四川大学化学工程学院制药与生物工程系，四川 成都 610065）

以可聚合的β-环糊精衍生物丁烯二酸单酯化-β-环糊精为功能单体，在一定的条件下，与采用含有乙烯基的偶联剂进行表面改性的Fe3O4纳米颗粒，通过自由基共聚法，制备一种带有环糊精基团的磁性纳米颗粒。通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜表征其形貌；红外光谱和X-射线衍射表征结构；振动样品磁强计表征其磁性；热重分析仪表征热稳定性。随后对其在不同表面活性剂中的分散稳定性进行测定，并通过细胞毒性试验对含有表面活性剂的分散体系的生物相容性进行研究。在此基础上，以抗癌药物卡莫氟为模型药物考察载体的载药性能。实验结果表明该磁性纳米颗粒有望作为药物载体应用在抗肿瘤药物靶向给药领域。

磁性纳米颗粒；β-环糊精；靶向载体；载药性能

0 引 言

癌症是严重威胁人类健康的疾病之一，目前主要的治疗方法是化学药物治疗法。然而许多抗癌药物和抗癌剂的组织特异性差、水溶性不高，导致生物利用率低，毒副作用大，严重限制其在临床中应用[1]。近年来，随着纳米医学的不断发展，抗肿瘤药物的靶向控制释放治疗受到了研究者们的广泛关注[1-2]。通过靶向载体可将抗癌药物有选择性地集中释放在病灶部位，从而提高药物治疗效果和减少药物对正常组织的毒副作用。磁性靶向给药系统是近年来国内外研究较多的一种新型靶向给药载体。其中，超顺磁Fe3O4纳米颗粒具有制备方便、超顺磁性、生物相容性较好的特点，在磁靶向载体中应用广泛[3-4]。理想的磁靶向给药载体不但要求纳米颗粒具有高磁饱和度，而且其表面要有可以负载药物的功能性基团以及良好的水介质分散稳定性。但是未经修饰改性的Fe3O4纳米颗粒不但由于粒子间存在的偶极-偶极吸引作用、范德华作用力而易相互聚集，而且载药量难以满足需求，因此需要对其进行表面改性。

β-环糊精以天然高分子物质为来源，不但具有来源广泛、价格低廉、无毒且可生物降解的优点，而且具有外缘亲水而内腔疏水的独特空腔结构，可以根据疏水作用力、范德华力及主客体分子间的匹配等作用与多种药物分子形成主-客体包合物[5]。β-环糊精及其衍生物通过与药物分子形成包合物，不但能将药物增溶于水，而且可以提高药物的稳定性和生物利用度。基于此，本文以水溶性β-环糊精衍生物丁烯二酸单酯化-β-环糊精（MA-CD）为功能单体，对Fe3O4纳米颗粒表面进行修饰改性，得到一种带有环糊精基团的磁性纳米颗粒，并对其性能进行了一系列的研究，以期用作磁靶向给药载体。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

β-环糊精（质量分数 98%）、3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷 （KH-570，97%）、偶氮二异丁腈、顺丁烯二酸酐均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。噻唑兰（MTT）和二甲亚砜购于美国Sigma公司。氯化亚铁、氯化铁、二甲基甲酰胺、丙酮等常用试剂均购于成都科龙化工试剂厂。

所制备磁性纳米颗粒的形貌采用Merlin compact-61-78型扫描电子显微镜 （德国蔡司集团）和JEM2100型透射电子显微镜（日本电子株式会社）进行表征；磁性性能采用Versalab型振动样品磁强计（美国量子设计公司）进行表征；结构采用Spectrum Two L1600300型红外光谱仪（美国珀金埃尔默股份有限公司）和D8型X-射线衍射仪（德国布鲁克科技有限公司）进行表征；热稳定性采用TG209F1型热重分析仪（德国耐驰仪器制造有限公司）进行表征。纳米颗粒在表面活性剂中的透过率和卡莫氟溶液的吸光值分别通过TU-1810型紫外分光光度计进行测定（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 KH-570修饰的Fe3O4纳米颗粒的制备

[6]报道的方法，采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，将得到的磁流体分散于120 mL乙醇和30mL水的混合溶液中，搅拌10min后依次加入3 mL氨水和2 mL正硅酸乙酯，常温搅拌24 h后，在外加磁场的作用下分离出硅化后的磁性纳米颗粒（SMNPs），洗涤后真空干燥得到产物。

准确称取1g干燥后的SMNPs，超声分散在100mL二甲基甲酰胺中，搅拌10min后，在氮气的保护下，逐滴加入5 mL KH-570，100℃反应12 h，磁性分离出产物，洗涤后真空干燥得到偶联剂修饰的磁性纳米颗粒（SMNPs-KH570）。

1.2.2 MA-CD-MNPs的制备

首先根据文献[7]方法制备了丁烯二酸单酯化-β-环糊精，以偶氮二异丁氰作为聚合反应的引发剂。准确称取0.5g SMNPs-KH570，超声分散在50mL二甲基甲酰胺中，机械搅拌10min后，加入0.25g丁烯二酸单酯化-β-环糊精，通氮气30min后升温至70℃，逐滴加入含有0.05g偶氮二异丁氰的二甲基甲酰胺溶液10mL，氮气保护下反应4h。磁性分离出产物，洗涤后真空干燥得到丁烯二酸单酯化-β-环糊精修饰的磁性纳米颗粒（MA-CD-MNPs）。

1.2.3 MA-CD-MNPs分散稳定性的测定

按实验设计称取不同类型和用量的表面活性剂，分散在50mL模拟体液中以配制不同的分散溶液，准确称取10 mg MA-CD-MNPs超声分散在分散溶液中配成质量浓度为0.2g/L的悬浮液，取3mL于比色皿内，采用紫外分光光度计，在设定的时间点记录其在500nm下透过率[8]。随着纳米颗粒的团聚，其在重力的作用下会逐渐沉降，透过率增大，因此可以通过透过率的变化来衡量表面活性剂的分散能力。

1.2.4 细胞毒性实验

本部分选用人体肝癌细胞HEPG-2，采用MTT法进行生物相容性表征[9]。具体步骤如下：配置一定浓度采用表面活性剂分散的药物载体悬浮液，待用。细胞株以每孔2×104～4×104个细胞的密度接种到96孔培养板上，在含有5%CO2的湿润空气氛围下培养24h后更换新鲜的培养基，再分别加入预定浓度的悬浮液，平行操作3份。继续将96孔板培养72h后，吸去孔内的上清液，用新鲜PBS缓冲溶液洗涤后在每孔中加入20μL MTT液体（5mg/mL），37℃继续培养4h，终止培养。弃去上清液，每孔加150μL二甲亚砜，避光振荡10min使结晶物充分溶解。使用自动酶标仪检测570nm波长处的吸光度值。细胞存活

其中Asample、Acontrol和Ablank分别代表样品孔、对照孔和空白孔在570nm处的吸光度值。样品孔为加入待测样品的细胞和培养液，对照孔为未加待测样品的细胞和培养液，空白孔为未加细胞的培养液。

1.2.5 MA-CD-MNPs载药性能的考察

本部分选择常用的广谱抗癌药物卡莫氟（HCFU）为模型药物考察载体的载药性能。具体操作如下：取一定体积和浓度的卡莫氟溶液于100 mL具塞锥形瓶中，加入15 mg左右的MA-CD-MNPs，超声分散后将锥形瓶密闭，置于一定温度的气浴振荡器中，设定摇床转速为150r/min。震荡一段时间后，在外加磁场的作用下，分离磁性纳米颗粒与溶液，取适当清液稀释至一定浓度，于260 nm处测定吸光值，根据标准曲线（y=0.045 6x（mg/L）+0.004，r2=0.999 8），计算出溶液中剩余卡莫氟的质量浓度。根据下式计算出药物载体的载药量：率按下式计算：

式中：Q——靶向载体对卡莫氟的载药量，mg/g；

V——卡莫氟溶液的体积，mL；

M0——靶向载体的质量，g；

C0——卡莫氟溶液的初始质量浓度，mg/L；

Ct——载药后卡莫氟溶液的质量浓度，mg/L。

2 结果与讨论

2.1 磁性纳米颗粒的表征

所制备的MA-CD-MNPs的扫描电镜和透射电镜结果分别如图1（a）和图1（b）所示，从图中可以看出，MA-CD-MNPs主要成球形且具有典型的核壳型结构，即Fe3O4纳米颗粒为核，所接枝的聚合物为壳。根据统计的结果，微球的平均粒径为（90±3）nm。研究表明，粒径在10～200nm且表面附有亲水基团的粒子能够避免巨噬细胞的识别，可以作为药物载体[3]。但从图中可以发现，表面改性的磁性纳米颗粒之间仍出现了一定程度的团聚现象。为了使其能用于靶向给药，还需对其分散稳定性进行改进。

用XRD和FT-IR对所制备的磁性纳米颗粒的结构进行表征。 图 2（a）和图 2（b）分别是 SMNPs和MA-CD-MNPs的X-射线衍射谱图。从图2（a）中可以观察到6个明显的特征衍射峰，和粉末衍射标准联合委员会（JCPDS）粉末衍射标准卡（JCPDS No.85～1 436）上的特征峰值 2θ=30.1（220），35.5（311），43.1（400），53.4（422），57.0（511）和 62.6（440）进行比对可知，本文制备的氧化铁纳米颗粒为纯净的Fe3O4单相立方晶颗粒。在图2（b）中依然可以观察到这6个特征峰，表明制备MA-CD-MNPs的过程并未改变Fe3O4纳米颗粒的晶型和结构。但由于接枝了环糊精基团，对应特征吸收峰处的衍射强度有所降低。

图1 MA-CD-MNPs的扫描电镜图和透射电镜图

FT-IR结果如图3所示，所有红外曲线均在580cm-1左右出现了Fe3O4的Fe-O特征伸缩峰[4，6]。为了赋予Fe3O4纳米颗粒更好的反应活性，首先对其表面进行了硅化，其红外图谱如图3（a）所示，在1093 cm-1和800 cm-1左右分别是 Si-O（Si-O-Si）的反对称振动吸收峰和对称振动吸收峰，在3444cm-1左右出现了-OH的伸缩振动吸收峰[5]。在接枝带有双键的偶联剂KH-570后，在1 720 cm-1和1 648 cm-1处分别出现了C=O和C=C的伸缩振动峰，在2928cm-1和2 848 cm-1处分别出现了-CH3和-CH2的特征吸收峰（见图3（b））。在与丁烯二酸单酯化-β-环糊精发生聚合反应后，C=C的特征吸收峰由于共轭作用而发生红移，向低波数移动，而且在1 528 cm-1处出现了C=C键反对称伸缩振动峰。除此之外，由于环糊精基团的引入，在1000～1200cm-1附近的吸收变强，在 3400cm-1附近的吸收峰变宽（见图 3（c））[7]。

图2 SMNPs和MA-CD-MNPs的X-射线衍射谱图

图3 SMNPs，SMNPs-KH-570和MA-CD-MNPs的红外光谱图

图4 是SMNPs和MA-CD-MNPs在300K下测得的磁滞回线图。从图中可以看出，SMNPs和MACD-MNPs的磁滞回线均呈S形，质量比剩余磁化强度和矫顽力均极小，显示出典型的超顺磁特性，其饱和磁化强度分别为49.98 emu/g和29.80 emu/g。MA-CD-MNPs的磁饱和度比SMNPs要低，源于修饰颗粒中含有一定量的非磁性物质，即接枝上去的环糊精衍生物，从而导致单位质量的饱和磁化强度有所降低，但仍然能够在外加磁场的作用定向移动，可以用作磁靶药物向载体。

图4 SMNPs和MA-CD-MNPs在300K温度下的磁滞回线图

上述表征均说明了丁烯二酸单酯化-β-环糊精成功接枝在Fe3O4纳米颗粒表面，为了研究所制备的磁性纳米颗粒的热稳定性和定量分析环糊精衍生物的接枝量，采用热重分析进行了表征，结果如图5所示。从图中可以看出MA-CD-MNPs的热失重可分为两个阶段，第1个阶段是从室温下开始加热到100℃左右，出现了约2%的热失重，这应归因于颗粒所吸附水分的蒸发。第2阶段是从220℃到675℃出现了约10.55%的失重量，这部分失重应该是所接枝上的有机组分。SMNPs-KH-570的失重温度和范围与MA-CD-MNPs基本一致。综合以上数据进行分析可以推算出，接枝在Fe3O4纳米颗粒表面的丁烯二酸单酯化-β-环糊精占颗粒总重的8.03%。

2.2 MA-CD-MNPs分散稳定性研究

图5 SMNPs-KH-570和MA-CD-MNPs的热重分析曲线

通过前期的文献调研和预实验的结果发现对同一种表面活性剂来说，影响MA-CD-MNPs在模拟体液中分散性能的主要因素是表面活性剂的浓度，这是因为纳米颗粒表面可供吸附的面积有限，当表面活性剂在颗粒表面达到饱和吸附后，多余未吸附的分子链便会通过桥连作用使原本分散的颗粒再次团聚，导致其分散性变差[10]。因此首先对不同类型的表面活性剂最佳浓度进行了优化，然后再比较不同种类表面活性剂对纳米颗粒分散性的影响。实验共选择了6种表面活性剂，其中两种非离子型表面活性剂：聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮；3种阴离子型表面活性剂：十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、羧甲基纤维素钠；一种氨基酸类表面活性剂：N-月桂酰肌氨酸钠。实验结果如图6所示，随着时间的增加，分散系统的透过率逐渐增加，其中透过率变化最小，即分散效果最好的表面活性剂是质量分数0.5%的羧甲基纤维素钠，说明该分散剂与MA-CD-MNPs间的相互作用最强，容易吸附在颗粒表面形成双电层或空间位阻结构，从而显著改善其分散稳定性。

2.3 细胞毒性研究

理想的磁靶向给药系统不仅要具备一定的磁响应性，还要有良好的生物相容性。因此有必要对上述优选出的含有0.5%的羧甲基纤维素钠的MA-CDMNPs悬浮液的细胞毒性进行研究。实验结果如图7所示，该悬浮液在所测试的浓度范围内对细胞的活力基本没有影响，具有良好的生物相容性。

根据报道[11]，单独裸露的Fe3O4纳米颗粒在质量浓度为50μg/mL时，就会导致细胞活力下降20%，这主要是由细胞间内吞作用导致。研究表明，在Fe3O4纳米颗粒表面偶联亲水性材料进行修饰，可形成一层动态的亲水性物，有效降低细胞毒性[12]。因此，将β-环糊精的亲水性衍生物丁烯二酸单酯化-β-环糊精接枝在Fe3O4纳米颗粒有助于提高纳米颗粒的生物相容性。除此之外，羧甲基纤维素钠作为一种阴离子型表面活性剂，相较于阳离子型来说，不易与带负电的细胞表面相互作用，因此细胞毒性较小。因此整个分散体系具有良好的生物相容性。

图6 MA-CD-MNPs在不同表面活性剂中透过率随时间变化图

图7 含有羧甲基纤维素钠的MA-CD-MNPs悬浮液对HEPG-2细胞的细胞毒性

2.4 靶向载体载药性能的考察

以广谱抗癌药物卡莫氟为模型药物对纳米颗粒的载药性能进行考察，通过单因素实验对载药条件进行了优化，由图8可知该纳米颗粒对卡莫氟的最佳载药条件为：卡莫氟溶液的质量浓度为50 mg/L（图8（a））；载药作用时间为3 h（图 8（b））；载体与溶液的质量体积比为 15 mg∶40 mL（图 8（c））；载药温度为 35 ℃（图8（d））。在此条件下，得到对卡莫氟的最大载药量为（12.36±0.72）mg/g。 实验结果表明，该磁性纳米颗粒具备良好的载药性能，可以用作磁靶向给药载体。

3 结束语

本文采用自由基聚合法，将β-环糊精的水溶性衍生物丁烯二酸单酯化-β-环糊精（MA-CD）成功接枝在Fe3O4纳米颗粒的表面。所制备的磁性纳米颗粒主要呈球型且是典型的核壳型结构，平均粒径为（90±3）nm。VSM曲线表明该磁性纳米颗粒具备良好的顺磁性，在外加磁场的作用下可以实现定向移动。通过对纳米颗粒的热稳定性研究得到接枝在Fe3O4纳米颗粒表面的MA-CD占颗粒总重的8.03%。为了进一步改善磁性纳米颗粒在水介质中的分散稳定性，对其在6种不同类型的表面活性剂中分散性能进行了研究，结果表明质量分数为0.5%的羧甲基纤维素钠的分散性能最好。细胞毒性研究结果证明了含有0.5%的羧甲基纤维素钠的MA-CD-MNPs悬浮液具有良好的生物相容性。以抗癌药物卡莫氟为模型药物的载药实验结果表明了该磁性纳米颗粒具有良好的载药性能，对卡莫氟的最大载药量达到（12.36±0.72）mg/g。 综上可知，本实验所制备的磁性纳米颗粒有望用于磁靶向给药领域。

图8 MA-CD-MNPs对卡莫氟载药性能的单因素考察结果

参考文献

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（编辑：莫婕）

Preparation and characterization of magnetic nanoparticles based on maleated-β-cyclodextrin

CHEN Pengfei，SONG Hang，LI Fulin，TANG Mengyu，ZHOU Lu
（Department of Pharmaceutical Engineering and Biological Engineering，School of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China）

Maleated-β-cyclodextrin was first synthesized and then its functionalized Fe3O4magnetic nanoparticles MA-CD-MNPs were prepared via free radical copolymerization of maleated-βcyclodextrin on the surface of Fe3O4magnetic nanoparticles（MNPs） modified by 3-methacryl oxypropylt rimethoxy silane which has reactive double carbon bonds.The morphology，structure，magnetic property，and component of MA-CD-MNPs were characterized by SEM，TEM，FT-IR，XRD，VSM and TGA.The colloidal stabilities of MA-CD-MNPs in kinds of surfactant were investigated.Furthermore，the cell cytotoxicity of nanosystem containing the surfactant was assessed by MTT assay.And then，carmofur was selected as model drug to investigate the loading capacity of the MA-CD-MNPs.The MA-CD-MNPs were anticipated to act as a promising candidate of targeted nanocarrier for anti-cancer drugs.

magnetic nanoparticles；β-cyclodextrin；targeted nanocarrier；loading capacity

A

1674-5124（2017）04-0038-06

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.04.009

2016-11-10；

2016-12-25

陈鹏飞（1989-），男，博士，研究方向为磁性聚合物功能材料。

周 鲁（1954-），男，教授，博导，主要从事药物定量构效关系和定量构动关系研究。