白血病微卫星不稳定与靶基因移码突变的研究

母光福，李文锦，李璨，陈方平

（中南大学湘雅医院 血液科，湖南 长沙 410008）

白血病微卫星不稳定与靶基因移码突变的研究

母光福，李文锦，李璨，陈方平

（中南大学湘雅医院 血液科，湖南 长沙 410008）

目的 探究微卫星不稳定（MSI）的急性淋巴细胞白血病（ALL）中SETD1B和TTK基因微卫星序列移码突变的情况。方法采用荧光片段聚合酶链反应（PCR）对ALL细胞株和临床样本行MSI检测。采用基因测序和荧光片段PCR检测SETD1B、TTK基因微卫星序列的移码突变。结果ALL细胞株MSI阳性率为80.0%（4/5）；儿童ALL患者骨髓样本MSI阳性率为25.0%（3/12）；成人ALL患者骨髓样本MSI阳性率为20.0%（2/10）。Molt4细胞株中SETD1B基因微卫星序列存在移码突变c.22delC，TTK基因微卫星序列存在移码突变c.2560delA；CCRF-CEM细胞株中SETD1B基因微卫星序列存在移码突变c.22delC；ALL患者骨髓样本中SETD1B和TTK基因微卫星序列均未检测到上述移码突变。结论MSI诱导SETD1B和TTK基因微卫星序列移码突变可发生于ALL细胞株。

微卫星不稳定；白血病；移码突变

微卫星是短串联重复DNA序列，微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）是微卫星序列重复数目的改变[1]。含SET结构域蛋白1B（SET domain containing 1B，SETD1B）基因编码蛋白参与催化组蛋白H3第4位赖氨酸（histone H3 lysine 4，H3K4）甲基化[2]。酪氨酸苏氨酸激酶（tyrosine threonine kinase，TTK）基因编码蛋白参与有丝分裂检测点功能[3]。MSI诱导SETD1B、TTK基因移码突变参与结直肠癌的发生、发展[4-5]。急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）中也存在 MSI现象，但是否存在SETD1B、TTK基因移码突变尚不清楚[6]。本研究通过荧光片段聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）与基因测序检测ALL中MSI现象与SETD1B、TTK基因的移码突变。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人 ALL 细 胞 株 REH、Molt4、Daudi、Jurkat、CCRF-CEM及人结肠癌细胞株RKO购自上海中国科学院上海细胞库，胎牛血清（美国Hyclone公司），无血清细胞冻存培养基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）（美国 Hyclone 公司），MEM/EBSS液体培养基（美国Gibco公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司），淋巴细胞分离液（北京赛驰生物科技有限公司），QIAamp DNA Blood Mini Kit（德国 Qiagen公司），2×Phanta Max Master Mix（南京诺唯赞生物科技公司），Roche Fast Start Taq DNA polymerase（瑞士 Roche 公司），2.5×Buffer（北京阅微基因技术有限公司），ROX-500分子量内标（北京阅微基因技术有限公司）。SETD1B基因第1外显子正向引物：5'-CTGCCGATTGGATTCTTTCGCG TG-3'，反向引物：5'-CTCGAGGCACTTGTCAAACTC CAG-3'；TTK基因第22外显子正向引物：5'-GAAC ACTATAGTGGTGGTGAAAGTC-3'，反向引物：5'-TA TACAGTGCCATAAGTGGTTGC-3'均由上海捷瑞公司合成。SETD1B基因第1外显子荧光片段PCR正向引物：FAM-5'-GATTCTTTCGCGTGTGTGTAGA-3'，反向 引 物 ：5'-GGGTCAATCATCAACTTGTAACTT-3'；TTK基因第22外显子荧光片段PCR正向引物：FAM-5'-TTCCCAACTGTAAGAACAAGAGAGA-3'，反向引物：5'-TTGCTGATAACACTTCAGAGTGATG-3'均由北京阅微基因技术有限公司合成。Gene Amp 9700 PCR仪、3130xl DNA analyzer仪均购自美国ABI公司，稳压DNA电泳仪（美国BioRad公司），凝胶成像仪（上海天能公司）。

1.2 细胞培养

将 REH、Molt4、Daudi、Jurkat、CCRF-CEM 细胞株培养于含12%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿度培养箱内传代培养，取对数生长期细胞用于实验。将RKO细胞株培养于含10%胎牛血清的MEM/EBSS液体培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 临床样本及健康志愿者样本

选取2016年9月1日-2017年2月20日在中南大学湘雅医院初诊的22例ALL患者，年龄2～68岁，平均19.1岁；其中儿童12例（年龄＜14岁），成人10例（年龄≥14岁）；女性7例，男性15例；低危或标危3例，高危19例；B细胞ALL 19例，T细胞ALL 3例；采集骨髓样本于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-K3 抗凝管中，采用淋巴细胞分离液法分离单个核细胞用于后续实验。10例健康志愿者，年龄21～46岁，平均31.6岁，其中男性4例，女性6例，采集外周血样本于EDTA-K3抗凝管中用于后续实验；患者或家属、健康志愿者均签署知情同意书，并经本院伦理委员会批准。

1.4 DNA提取

取对数生长期细胞或原代骨髓单个核细胞，悬浮于200μl磷酸盐缓冲溶液中，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit说明书提取基因组DNA。取200μl健康志愿者外周血标本，按QIAamp DNA Blood Mini Kit说明书提取基因组DNA。

1.5 MSI检测

以基因组DNA为模板，用荧光片段PCR对BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27 及 MONO-27 6个单核苷酸重复位点进行复合扩增，在ABI 3130xl型遗传分析仪上进行分析[7]。

1.6 Sanger测序

加入 2×Phanta master mix 25 μl，正反向引物各 1 μl，基因组 DNA 200 ng，加双蒸水补足 50 μl，进行PCR扩增反应，扩增产物经凝胶成像后在ABI 3130xl型遗传分析仪上进行结果分析。

1.7 荧光片段PCR检测

加 入 2.5 ×Buffer 4 μl，Roche Fast Start Taq DNA polymerase 0.2 μl，正反向引物各 1 μl，基因组DNA 100 ng，加双蒸水补足 10 μl，进行 PCR 扩增反应，采用荧光标记的引物在Gene Amp 9700 PCR仪中扩增，扩增产物在ABI 3130xl型遗传分析仪中行片段长度分析。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计数资料以率（%）表示，用Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALL细胞株中存在MSI现象

微卫星标志位点通过荧光片段PCR检测，微卫星标志位点PCR产物长度相差≥3 bp的片段为MSI阳性状态。80.0%（4/5）ALL细胞株为MSI阳性，其中 REH、Molt4、Daudi、Jurkat为 MSI阳性细胞株；CCRF-CEM为MSI阴性细胞株；对照组结肠癌细胞株RKO为MSI阳性细胞株。见附表。

附表 MSI与靶基因移码突变的关系

2.2 ALL临床样本中存在MSI现象

共纳入22例ALL患者，其中12例ALL患儿（年龄＜14岁）根据初诊时的资料，按照儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第4次修订）标准[8]，分为低危组、标危组及高危组；10例成人ALL患者（年龄≥14岁）根据初诊时资料，按中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南（2016年版）标准[9]，分为标危组和高危组。初治ALL患儿骨髓样本MSI阳性率为25.0%（3/12），初治成人ALL患者骨髓样本MSI阳性率为20.0%（2/10），经Fisher确切概率法，差异无统计学意义（P=1.000）；女性患者骨髓样本MSI阳性率为14.3%（1/7），男性患者骨髓样本MSI阳性率为26.7%（4/15），经Fisher确切概率法，差异无统计学意义（P=1.000）；低危或标危组ALL患者骨髓样本MSI阳性率为33.3%（1/3），高危组ALL患者骨髓样本MSI阳性率为21.1%（4/19），经Fisher确切概率法，差异无统计学意义（P=1.000）；B细胞ALL患者骨髓样本MSI阳性率为21.1%（4/19），T细胞ALL患者骨髓样本MSI阳性率为33.3%（1/3），经Fisher确切概率法，差异无统计学意义（P=1.000）。10例健康志愿者外周血标本均为MSI阴性。

2.3 基因测序在ALL细胞株中检测到SETD1B和TTK基因移码突变

在Molt4细胞株中SETD1B基因第1外显子C8微卫星序列存在移码突变c.22delC，TTK基因第22外显子A9微卫星序列存在移码突变c.2560delA；在CCRF-CEM细胞株中SETD1B基因第1外显子C8微卫星序列存在移码突变c.22delC，TTK基因第22外显子A9微卫星序列为野生型；在RKO细胞株中SETD1B基因第1外显子C8微卫星序列存在突变c.22delC，TTK基因第22外显子A9微卫星序列存在突变 c.2560delA；在 REH、Daudi、Jurkat细胞株中SETD1B第1外显子C8微卫星序列、TTK基因第22外显子A9微卫星序列均为野生型（见图1、2）。22例ALL原代骨髓单个核细胞基因组DNA及10例健康志愿者外周血基因组DNA中SETD1B第1外显子C8微卫星序列、TTK基因第22外显子A9微卫星序列均为野生型。

2.4 荧光片段PCR在ALL细胞株中检测到SETD1B和TTK基因移码突变

在Molt4细胞株中，SETD1B基因第1外显子C8微卫星序列存在2个片段长度，该2个片段长度相差1 bp，TTK基因第22外显子A9微卫星序列存在2个片段长度，该2个片段长度相差1bp；在CCRFCEM细胞株中，SETD1B基因第1外显子C8微卫星序列存在2个片段长度，该2个片段长度相差1 bp，TTK基因第22外显子A9微卫星序列片段仅存在1个片段长度；在RKO细胞株中，SETD1B基因第1外显子C8微卫星序列存在2个片段长度，该2个片段长度相差1 bp，TTK基因第22外显子A9微卫星序列存在2个片段长度，该2个片段长度相差2 bp；在 REH、Daudi、Jurkat细胞株中，SETD1B 基因第 1外显子C8微卫星序列有且仅有1个片段长度，TTK基因第22外显子A9微卫星序列有且仅有1个片段长度（见图3、4）。22例ALL原代骨髓单个核细胞基因组DNA及10例健康志愿者外周血基因组DNA中SETD1B基因第1外显子C8微卫星序列有且仅有1个片段长度，TTK基因第22外显子A9微卫星序列有且仅有1个片段长度。

图1 SETD1B基因第1外显子C8微卫星序列Sanger测序

图2 TTK基因第22外显子A9微卫星序列Sanger测序

图3 SETD1B基因第1外显子C8微卫星序列荧光片段

图4 TTK基因第22外显子A9微卫星序列荧光片段

3 讨论

本实验通过6个单碱基串联序列位点BAT25、BAT26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO27 检测白血病细胞的微卫星状态，发现 REH、Molt4、Jurkat、Daudi细胞株均为MSI阳性，与HAM等[10]报道的结果一致。BEST等[6]报道，CCRF-CEM细胞株是MSI阳性，而本研究中CCRF-CEM细胞株被认定为MSI阴性，这可能与微卫星标志位点选择差异相关。MSI现象最早发现于结直肠肿瘤中，其在结直肠癌中的研究较为成熟，具备较完善的MSI状态判断标准[1]。对于白血病，目前尚无统一的MSI状态判断标准，同一细胞株微卫星状态在不同的研究报道可不一致。因此，在白血病中尚需寻找高敏感性、高特异性的MSI的检测标志组合。

本研究发现，初治ALL患者的MSI阳性率较低，其中初治ALL患儿骨髓样本MSI阳性率为25.0%，初治成人ALL骨髓样本MSI阳性率为20.0%，与SELLICK等[11]的报道一致。本研究样本量较小，缺乏复发难治ALL患者中MSI发生的资料，但有研究报道MSI更易发生于复发或继发白血病[12-13]。本研究还发现，B细胞ALL骨髓样本MSI阳性率为21.0%，T细胞ALL骨髓样本MSI阳性率为33.3%，B细胞白血病的MSI阳性率比T细胞白血病低，与INOUE等[14]的报道一致。有研究报道，MSI阳性的白血病倾向于发生在免疫抑制状态的患者[15]。总结既往研究可发现，血液肿瘤的MSI阳性率比实体肿瘤低，原发和初治白血病的MSI阳性率比继发和复发白血病低，髓系白血病MSI阳性率比淋系白血病低，B细胞白血病MSI阳性率比T细胞白血病低。这是因为MSI导致靶基因移码突变所产生的异常蛋白，可诱导机体产生特异性活化T细胞，反而抑制MSI阳性细胞的生存[16]。肿瘤细胞诱发免疫应答的能力与机体的免疫状态造成不同肿瘤MSI阳性率的差异。基于该观点，有研究者尝试运用MSI阳性白血病中的异常蛋白，诱导机体产生特异性活化的T细胞，对该疾病进行免疫治疗[17]。MSI阳性白血病的靶向免疫治疗处于初始阶段，仍需要更多研究阐明其机制。

在急性白血病中，MSI的靶基因包括转化生长因子β受体Ⅱ类（transforming growth factor-β receptor typeⅡ，TGFβRⅡ）基因、双链断裂修复MRE11 基因等[10，14，18]。本研究通过 Sanger测序及荧光片段PCR 2种独立的方法，首次报道在Molt4、CCRF-CEM细胞株中SETD1B基因存在移码突变c.22delC。但在22例ALL临床骨髓样本中，未检测到该突变，这可能是因为样本量太小，或该突变的发生率不高所致。SETD1B是一种重要的组蛋白甲基化相关基因，其编码的蛋白是组蛋白H3K4位点甲基化的重要催化酶[2]。组蛋白甲基化异常是白血病发生、发展的重要因素[19]。SETD1B基因移码突变是否会导致其表达异常，以及如何参与白血病的发生、发展，仍需进一步研究阐明。本研究通过Sanger测序及荧光片段PCR 2种独立的方法，发现在Molt4细胞株中TTK基因存在突变c.2560delA。本研究在22例ALL临床骨髓标本中未检测到该突变，这可能是因为样本量太小，或该突变的发生率不高所致。TTK所编码的蛋白激酶，主要参与有丝分裂中纺锤体形成检测点功能，确保姐妹染色单体连接在纺锤体上后，才启动有丝分裂后期[20-21]。有丝分裂中纺锤体形成检测点功能的异常可发生于乳腺癌、结直肠癌等实体肿瘤中[5，22]。CAMACHO等[23]在淋巴瘤中也发现TTK基因突变，但该突变并非是MSI诱导的移码突变。在白血病中，MSI诱导的TTK基因移码突变是否会影响其表达与功能仍需进一步研究证实。

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（童颖丹 编辑）

Microsatellite instability and target gene frameshift mutations in leukemia

Guang-fu Mu,Wen-jin Li,Can Li,Fang-ping Chen
(Department of Hematology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

ObjectiveTo investigate frameshift mutations of microsatellite sequence inSETD1BandTTK genes in acute lymphoblastic leukemia (ALL)with microsatellite instability (MSI).MethodsFluorescent fragment PCR was used for defining the microsatellite status of ALL cells both in cell lines and bone marrow samples.Sanger sequencing and fluorescent fragment PCR were used for the detection of frameshift mutations of microsatellite sequences inSETD1BandTTKgenes in ALL cells with MSI both in cell lines and bone marrow samples.ResultsThe incidence of MSI in the ALL cell line was 80.0% (4/5).The incidence of MSI in the child ALL cells was 25.0% (3/12).The incidence of MSI in the adult ALL was 20.0%(2/10).Frameshift mutations of c.22delC inSETD1Bgene and c.2560delA inTTKgene were detected in Molt4 cell line.Frameshift mutation of c.22delC inSETD1Bgene was detected in CCRF-CEM cell line.None of the above frameshift mutations was detected in the ALL bone marrow samples.ConclusionsMSI inducedSETD1B andTTKgene frameshift mutations occur in the ALL cell lines.

microsatellite instability;leukemia;frameshift mutation

R733.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.008

1005-8982（2017）12-0040-06

2017-02-15

陈方平，E-mail：xychenfp@qq.com；Tel：13707485350