美洲大蠊提取物对人肝癌HepG2细胞的作用机制研究*

张蕊，袁发璐，李婷，彭芳

（大理大学 药学与化学学院，云南 大理 671000）

基础研究·论著

美洲大蠊提取物对人肝癌HepG2细胞的作用机制研究*

张蕊，袁发璐，李婷，彭芳

（大理大学 药学与化学学院，云南 大理 671000）

目的 探讨美洲大蠊提取物体外对肝癌（HCC）HepG2细胞增殖、迁移能力，以及细胞中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的影响。方法噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖；划痕实验检测美洲大蠊提取物对HCC细胞迁移能力的影响；免疫细胞染色法、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测美洲大蠊提取物对细胞中VEGF蛋白表达的影响。结果MTT和划痕实验结果表明，美洲大蠊多肽、CⅡ-3和脱脂膏能抑制人HCC HepG2细胞的增殖和迁移，且呈时间、剂量依赖关系；免疫细胞化学染色法和ELISA法结果显示，美洲大蠊多肽、CⅡ-3及脱脂膏能下调人HCC HepG2细胞中VEGF蛋白的表达。结论美洲大蠊多肽、CⅡ-3及脱脂膏能抑制人HCC HepG2细胞增殖和迁移，同时能降低HepG2细胞中VEGF蛋白的表达，且美洲大蠊多肽的作用优于CⅡ-3和脱脂膏。

美洲大蠊多肽；HepG2细胞；增殖和迁移；VEGF表达

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上 第7种常见的恶性肿瘤，居全球癌症病死率的第3位，恶性程度高，复发率高，易转移[1-2]。目前，越来越多的研究集中探讨HCC微环境的组成，以及对HCC发生、发展的作用[3]。

美洲大蠊为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称蟑螂[4]。本研究用美洲大蠊多肽（periplaneta americana polypeptide，PAP）PAP-1、PAP-2、PAP-3，以及抗肿瘤活性物质CⅡ-3和脱脂膏为实验用药，观察并比较美洲大蠊3个多肽和2个活性物质对人肝癌HepG2细胞的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

美洲大蠊多肽1、2和3（大理大学昆虫生物医药研究院），美洲大蠊CⅡ-3（黄褐色冻干粉末）和美洲大蠊脱脂膏（褐色黏稠膏状）（大理大学昆虫生物医药研究院张成桂博士提供），人肝癌HepG2细胞株（上海海博全尔生物科技有限公司），改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清、胰蛋白酶购自澳大利亚Gibco公司，青霉素链霉素混合液（美国Millipore公司），二甲亚砜、噻唑蓝[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、沙利度胺购自美国Sigma公司，一抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和兔IgG免疫组织化学法试剂盒（武汉博士德生物有限公司），人VEGF酶联免疫吸附试验 （enzymelinked immunosorbentassay，ELISA）试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司），医用洁净工作台和二级生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司），二氧化碳CO2培养箱（美国Nuaire公司），倒置相差显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 美洲大蠊多肽PAP-1、PAP-2及PAP-3母液的配制 美洲大蠊多肽PAP-1、PAP-2及PAP-3均用注射用水配置成浓度为1 mg/ml的母液，4℃保存。实验时用培养基将药物母液稀释至所需浓度即可。

1.2.2 细胞培养 人肝癌HepG2细胞株采用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验[5-6]。

1.2.3 MTT法检测用药后人肝癌细胞HepG2存活率 HepG2细胞（1×105个 /ml，100μl）接种于 96孔板，培养24 h。用浓度分别为6.25、12.50、25.00、50.00和 100.00 μg/ml的美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脱脂膏进行干预，每个浓度设6个复孔，200μl/孔，同时设置200 μg/ml沙利度胺组和对照组，继续培养24 h。用酶联免疫检测仪在490 nm处检测各孔吸光度值（Absozbance，A）。按以下公式计算细胞抑制率：细胞抑制率（inhibition rate，IR）（%）=[1-A加药组/A对照组]×100%[7-8]。

1.2.4 细胞划痕实验 分为对照组，沙利度胺组，美洲大蠊PAP-1、PAP-2、PAP-3组，CⅡ-3组，以及脱脂膏低、中、高剂量组（分别为 25、50 和 100μg/ml）[9-10]。HepG2细胞常规消化，按2×105个/ml的密度接种于6孔板，2 ml/孔。培养24 h后，用200μl枪头在6孔板底部划一条直线，磷酸盐缓冲溶液洗涤2、3次，按实验分组加入药物。分别对0和24 h的划痕进行拍照，并测量划痕宽度。以上实验重复3次，取平均值计算划痕愈合率。划痕愈合率=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.2.5 免疫细胞染色法 实验分组同1.2.4。取对数生长期的HepG2细胞，常规消化制备单细胞悬液，按2×105个/孔的密度接种于放有细胞爬片的6孔板中，2 ml/孔。培养24 h后，根据实验分组分别加入不同剂量的美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脱脂膏，继续培养48 h。按照免疫组织化学法步骤和试剂盒说明书进行实验，在倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.6 ELISA实验 HepG2细胞常规消化，以1×105个/ml的密度接种于96孔板，37℃培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，按1.2.4中实验分组加入不同浓度的药物，每个浓度设置3个复孔，200μl/孔。同时设置空白对照组和阳性对照组。分别培养24和48 h后收集细胞上清液，3 000 r/min离心15 min，取上清，置于-20℃冰箱冷冻保存备用。按照ELISA试剂盒说明书进行实验，酶标仪检测450 nm处各孔光密度（optical delnsity，OD）值。以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线对应的OD值，即可算出样品VEGF的浓度。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件和Origin Pro 8.6作图软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 美洲大蠊多肽提取物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

各组培养24、48和72 h的细胞抑制率比较，采用重复测量数据的方差分析，结果：①不同时间点测量的抑制率比较，差异有统计学意义（F=4247.101，P=0.000）；②不同药物处理后的抑制率比较，差异有统计学意义（F=2460.773，P=0.000）；③各组的细胞抑制率变化趋势有差异（F=85.030，P=0.000）。从用药浓度看，同一时间的美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脱脂膏对HepG2细胞增殖的抑制率呈浓度依赖性。200μg/ml沙利度胺对HepG2细胞的增殖抑制率亦呈时间依赖关系，其中以72 h抑制率为最高。各药物间作用比较，美洲大蠊3个多肽抑制HepG2细胞增殖的作用优于脱脂膏和CⅡ-3，其中多肽PAP-2抑制效果最好，而脱脂膏的作用又优于CⅡ-3。见表1和图1～3。

表1 美洲大蠊提取物对HepG2细胞增殖的影响 （n=3）

续表1

图1 美洲大蠊提取物干预24 h对HepG2细胞增殖的抑制作用

图2 美洲大蠊提取物干预48 h对HepG2细胞增殖的抑制作用

图3 美洲大蠊提取物干预72 h对HepG2细胞增殖的抑制作用

2.2 美洲大蠊提取物对HepG2细胞的迁移抑制作用

各组划痕愈合率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=433.771，P=0.000）。与对照组、沙利度胺组比较，经过 PAP-1、PAP-2、PAP-3、CⅡ-3及脱脂膏处理后，HepG2细胞的划痕愈合率降低，并且随着浓度增加，划痕愈合率逐渐降低，抑制细胞迁移具有浓度依赖性。见表2。

另外各药物对HepG2细胞迁移抑制作用比较，美洲大蠊多肽PAP-3的作用优于PAP-1、PAP-2、CⅡ-3及脱脂膏，而脱脂膏的作用好于PAP-1、PAP-2及CⅡ-3。见图4。

划痕24 h后，各组HepG2细胞发生明显迁移，划痕区域与0 h相比变窄，说明细胞HepG2细胞在划痕后能自动愈合。然而，在经过不同剂量的美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脱脂膏及200μg/ml沙利度胺干预24 h后，HepG2细胞的迁移距离均缩小，划痕愈合率逐渐降低。见图5。

2.3 美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脱脂膏对VEGF蛋白表达的影响

免疫细胞化学染色结果显示，VEGF的表达存在于HepG2细胞质中，棕色为VEGF蛋白表达，颜色深浅代表蛋白表达量的多少。未加药的对照组染色较深，呈现深棕色颗粒，表明VEGF蛋白表达高。美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脱脂膏作用后，VEGF的表达出现下调。且美洲大蠊多肽浓度越高，VEGF蛋白表达越少。而随着CⅡ-3和脱脂膏浓度的升高，VEGF表达增多。见图6。

2.4 美洲大蠊提取物干预后HepG2细胞上清液中VEGF含量比较

各组培养24和48 h后VEGF含量比较，采用重复测量数据的方差分析，结果：①不同时间点VEGF含量比较，差异有统计学意义（F=4773.712，P=0.000）；②不同药物处理后的VEGF含量比较，差异有统计学意义（F=45.148，P=0.000）；③各组的细胞抑制率变化趋势有差异（F=4.917，P=0.001）。与对照组比较，美洲大蠊多肽PAP-1、PAP-2及PAP-3作用24 h后，HepG2细胞上清液中VEGF含量降低，且呈浓度依赖性。低剂量和中剂量美洲大蠊CⅡ-3对HepG2细胞上清液中VEGF的表达无明显作用，而高剂量CⅡ-3促进VEGF的表达。低剂量和中剂量脱脂膏对VEGF的表达有下调作用，但随着浓度升高，VEGF的表达反而增多。各药物作用比较，美洲大蠊3个多肽下调VEGF含量的作用优于脱脂膏和CⅡ-3，其中多

表2 美洲大蠊多肽提取物对HepG2细胞迁移的影响（n=3）

图4 美洲大蠊提取物对HepG2细胞划痕愈合率的作用比较

图5 美洲大蠊提取物干预后HepG2细胞划痕愈合情况 （×40）

图6 美洲大蠊多肽提取物对HepG2细胞中VEGF蛋白表达的影响 （×200）

表3 美洲大蠊提取物干预后HepG2细胞中VEGF的含量比较 （n=3）

3 讨论

VEGF是一种特异性血管生长因子。有研究显示，其与多种肿瘤的发生、转移有关[11]。HCC属于典型的多血管实体瘤，其发生、发展过程与肿瘤血管生成密切相关。实体肿瘤长至直径2 mm后，后续的生长、转移及侵袭都需要新生血管生长提供营养[12]。有研究显示，美洲大蠊脱脂膏和CⅡ-3对多种人肿瘤细胞都有较好的抑制作用[13-19]。此外，CⅡ-3体内用药也有抑制多种肿瘤的作用[20-22]。美洲大蠊多肽为美洲大蠊抗肿瘤部位CⅡ-3的基本组分。

具有Arg-Gly-Asp肽特征的PAP-1和PAP-2呈现出抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）中 MMP-2 活性，以及明显抑制内皮肽PAP-3效果最好，而脱脂膏的作用又优于CⅡ-3。见表3和图7。

图7 美洲大蠊提取物干预24和48 h后HepG2细胞上清液中VEGF含量的变化

随着时间延长，作用48 h后，各组HepG2细胞上清液中VEGF含量增多，但是经过美洲大蠊多肽PAP-1、PAP-2及 PAP-3作用后，VEGF的含量下降。而CⅡ-3和脱脂膏作用后，VEGF的含量在一定程度上增加。细胞VEGF表达量的活性。大量研究表明，Arg-Gly-Asp肽具有抑制细胞黏附与迁移、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成的能力[23-26]。多肽分子PAP-3具有N-糖基化的特征，能提高荷瘤小鼠淋巴细胞增殖和增强IL-2分泌量。因此本实验选多肽PAP-1、PAP-2和PAP-3为主要实验用药。

本实验从细胞增殖开始，观察美洲大蠊多肽、CⅡ-3及脱脂膏对肝癌HepG2细胞的作用。结果表明，美洲大蠊多肽 PAP-1、PAP-2、PAP-3，CⅡ-3 及脱脂膏均能抑制HepG2细胞的增殖和迁移，且呈剂量、时间依赖关系，其中PAP-2增殖作用较优，PAP-3迁移效果较优；此外还能下调HepG2细胞中VEGF的表达，呈剂量依赖性，但随着时间延长，细胞数目增多，VEGF表达也增多，其中PAP-3效果较优。各部分实验结果综合表明，美洲大蠊多肽对HepG2细胞作用效果好于CⅡ-3和脱脂膏，3个多肽中PAP-3效果较好。该结果与实验预期相符，脱脂膏和CⅡ-3为美洲大蠊粗提物，成分与结构不明确，对肝癌细胞的作用是多种成分共同作用，而多肽是从CⅡ-3中提取得到的一系列明确的肽类分子，成分相对单一，其对肝癌细胞的作用可联系其系列分析。该结论为本课题组后续将多肽应用于动物体内实验或其他肿瘤细胞实验的相关研究提供有力的支持，也为作用机制的研究提供新的思路，同时为多肽类药物应用于肿瘤治疗提供新的可能性。

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（童颖丹 编辑）

Effect ofPeriplaneta Aamericanaextracts on HepG2 cells*

Rui Zhang,Fa-lu Yuan,Ting Li,Fang Peng
(College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of extracts fromPeriplaneta Aamericanaonin vitroproliferation,migration and VEGF protein expression of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells.MethodsScratch assay was applied to measure the effect of extracts fromPeriplaneta americanaon migration of HepG2 cells.Immunohistochemical staining and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)were used to detect the effect of extracts fromPeriplaneta americaon the expression of VEGF protein in the cells.ResultsMTT assay and Scratch assay showed thatPeriplaneta americanapolypeptides,CⅡ-3 and skimmed cream could inhibit the proliferation and migration of HepG2 cells in a time-and dose-dependent manner.Immunohistochemical staining and ELISA indicated thatPeriplaneta americanapolypeptides,CⅡ-3 and skimmed cream could down regulate the expression of VEGF protein in the cells.ConclusionsPeriplaneta americanapolypeptides,CⅡ-3 and skimmed cream can inhibit thein vitroproliferation and migration of HepG2 cellsin vitroin a timeand dose-dependent way,and reduce the expression of VEGF protein in the cells;and the effect ofPeriplaneta americanaextracts is better than that of CⅡ-3 and skimmed cream.

Periplaneta americanapolypeptide;HepG2 cells;proliferation and migration;VEGF

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.001

1005-8982（2017）12-0001-08

2017-01-03

国家自然科学基金（No：81560600）

彭芳，E-mail：pengfang101@sohu.com