益心酮片对亚急性酒精性肝损伤大鼠氧化应激的影响

2017-07-18李素婷高玉峰吴晓光

中国老年学杂志 2017年13期

关键词：过氧化酒精性脂质

李素婷王冉杜超高玉峰吴晓光

(承德医学院生化教研室，河北承德 067000)

益心酮片对亚急性酒精性肝损伤大鼠氧化应激的影响

李素婷王冉杜超高玉峰吴晓光

(承德医学院生化教研室，河北承德 067000)

目的研究益心酮片对亚急性酒精性肝损伤大鼠氧化应激的影响。方法选择雄性SD大鼠60只，随机分为正常组、模型组、益心酮低、高剂量组和维生素E组。以56°北京二锅头白酒连续灌胃4 w建立大鼠亚急性酒精性肝损伤模型，造模同时每天按剂量(100、200 mg/kg)给予益心酮干预，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性，肝组织丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，并进行肝脏病理学观察。结果益心酮能明显降低大鼠血清ALT、AST活性，提高肝组织SOD、GSH、GSH-Px活性，降低MDA含量，并能减轻酒精引起的肝组织病理损伤。结论益心酮可能通过提高内源性抗氧化能酶活性，抑制大鼠肝脏氧化应激损伤保护酒精性肝损伤。

益心酮；酒精性肝损伤；氧化应激

酒精性肝病是长期或大量饮酒所引起的肝脏损害〔1〕。酒精性肝病发病机制复杂，酒精及其代谢产物的毒性作用、氧化应激、细胞凋亡、免疫反应、肠源性内毒素、遗传因素等多种因素参与其发生发展〔2〕。目前研究认为，过量饮酒时酒精在肝脏代谢产生的活性氧(ROS)所引起的氧化应激是引起酒精性肝病的一个重要原因〔3〕。迄今为止，国内外对酒精性肝病尚无有效的干预措施，而中药具有多靶点、多层次、多途径及协调作用等特点，在抑制氧化应激，防治酒精性肝病方面具有一定的应用价值〔4〕。山楂叶总黄酮是一种天然的植物提取物，因富含黄酮类成分而具有明显的清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒调节免疫、保肝等广泛的药理作用〔5〕，其制剂益心酮片作为降血脂、预防心脑血管供血不足用药应用于临床。本研究观察益心酮对酒精所致大鼠肝脏氧化应激损伤的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性SD大鼠60只，体重(180±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：scxk(2007-2009)。适应性饲养1 w后进行实验，实验期间自由饮水及进食普通饲料。

1.2 药品、试剂及实验仪器益心酮片(山楂叶总黄酮制剂，每片含山楂叶总黄酮32 mg)：购于山西振东泰盛制药有限公司，临床应用2～3片/次，3次/d，即192～288 mg/d，以成人体重60 kg 计算，相当3.2～4.8 mg/kg。本实验给大鼠灌胃100、200 mg/kg，约为成人用量的20～40倍，临用前用蒸馏水将益心酮片配置成不同浓度的混悬液；56°红星二锅头白酒：北京红星酿酒厂生产；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所。半自动生化分析仪(MD-100)：美国Bayer公司；721W微机型分光光度计：上海光学仪器五厂；Olympus显微镜和组织切片机：德国Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及给药〔6〕60只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、益心酮低、高剂量(100、200 mg/kg)组和维生素E(100 mg/kg)组。正常组每天给予蒸馏水0.4 ml灌胃，其余各组每天上午按16 ml/kg剂量灌胃56°白酒1次，连续灌胃4 w造模结束。自造模第1天起，益心酮低、高剂量组在每天灌胃白酒1 h后，灌胃益心酮混悬液，维生素E组给予维生素E橄榄油溶液，正常组和模型组灌服等体积蒸馏水，实验期间各组大鼠自由饮水、进食。最后一次灌胃结束，禁食不禁水16 h，乙醚麻醉大鼠，剖腹取血、肝组织备用。

1.3.2 指标检测取血分离血清，半自动生化分析仪测定ALT、AST活性；取部分肝组织，用冷生理盐水冲洗后制备成10%的肝匀浆，按试剂盒说明书测定肝组织SOD、GSH、GSH-Px活性及MDA的含量。

1.3.3 肝脏病理学检查取大鼠肝组织，10%甲醛溶液常规固定，石蜡包埋、切片，HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理学变化。

1.4 统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，两组比较采用SNK法。

2 结果

2.1 益心酮对酒精性肝损伤大鼠血清ALT、AST活性的影响模型组大鼠血清ALT、AST活性均显著升高，和正常组比较有显著差异(P<0.05)；和模型组比较，益心酮低、高剂量组和维生素E组均能明显降低大鼠血清中ALT、AST活性(P<0.05，P<0.01)，表明益心酮能够保护大鼠肝细胞、稳定细胞膜结构，对酒精性肝损伤具有一定的保护作用，且维生素E组效果优于益心酮组。见表1。

2.2 益心酮对肝组织SOD、GSH、GSH-Px活性及 MDA含量的影响与正常组比较，模型组大鼠肝组织MDA含量明显升高，SOD、GSH、GSH-Px活性明显降低(P<0.01)；与模型组相比，益心酮低、高剂量组和维生素E组均可降低大鼠肝组织MDA含量，升高SOD、GSH、GSH-Px活性(P<0.05)。益心酮低、高剂量组之间比较，GSH、GSH-Px有显著差异(P<0.05)，SOD、MDA无明显差异。而维生素E组和益心酮各剂量组比较，MDA、SOD、GSH、GSH-Px均有显著差异(P<0.05)。表明益心酮能提高内源性抗氧化剂水平，具有清除自由基抗脂质过氧化反应的能力，并具有剂量依赖性。但抗脂质过氧化作用效果较弱于维生素E。见表1。

2.3 肝组织病理学变化各组大鼠肝组织HE染色后光镜下观察，正常组：肝小叶结构清晰，肝细胞形态正常，肝索排列整齐，肝组织无明显脂肪变性，肝小叶内未见肝细胞坏死及淋巴细胞浸润；模型组：肝小叶结构不清，可见点状、灶状坏死，肝细胞弥漫性肿胀，并有片状脂肪样变性，在汇管区有可见有炎症细胞浸润。益心酮各剂量组：肝小叶结构基本保留，肝细胞轻度水肿，脂肪样变性细胞明显减少，肝小叶内可见少量点状坏死及淋巴细胞浸润；维生素E组：肝小叶结构基本正常，肝细胞水肿及脂肪样变性明显减少，肝小叶内偶见少量点状坏死及淋巴细胞浸润。见图1。

表1 益心酮对各组大鼠血清ALT、AST活性及肝脏SOD、GSH、GSH-Px活性、MDA含量的影响

与正常组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.05，3)P<0.01；与益心酮低剂量组比较:4)P<0.05；与维生素E组比较:5)P<0.05

图1 益心酮对酒精性肝损伤大鼠肝组织病理改变的影响(HE，×200)

3 讨论

酒精过量摄入已成为我国病毒性肝炎之后导致肝脏损伤的第二大病因〔1〕。对我国人民身体健康和社会发展构成了严重威胁。研究表明，酒精在肝脏代谢过程中产生氧化应激是导致酒精性肝损伤最重要的一个原因〔7〕。大量饮酒后，酒精在肝脏经肝微粒体乙醇氧化系统(MEOS)代谢产生大量自由基(如：O2-·、OH-·、H2O2等)，这些自由基具有极强的氧化能力，可攻击肝细胞膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，破坏细胞膜和细胞器结构，改变膜流动性和通透性，影响DNA和蛋白质的结构和功能，并可引起肝内ATP和GSH耗竭，导致肝细胞广泛损伤〔8〕。脂质过氧化的代谢终产物MDA还可刺激机体产生抗体引起相应免疫应答，诱导炎症细胞因子基因的表达，进一步加重酒精性肝损伤〔9〕。机体在代谢酒精时会启动内源性抗氧化系统来干预氧化应激损伤，SOD是清除活ROS的主要的抗氧化酶，它可将氧自由基歧化为H2O2，H2O2进一步在过氧化氢酶、GSH-Px催化下被清除，保护肝细胞免被损伤。但是大量摄入酒精时，酒精可引起肝细胞内抗氧化物质(维生素E、C、A)明显减少，进而导致SOD活性下降，不能有效清除自由基，致使自由基在体内蓄积超过体内抗氧化酶代谢的能力，引起细胞膜发生脂质过氧化反应，对肝细胞造成损伤〔10〕。因此检测肝组织中SOD活性可以衡量肝脏清除自由基能力及机体抗氧化能力。GSH是细胞内游离的水溶性抗氧化剂，GSH-Px是体内广泛存在的抗脂质过氧化反应酶，GSH-Px特异催化GSH还原体内过氧化代谢产物，阻断脂质过氧化连锁反应，减轻过氧化物对细胞膜损伤，保护细胞膜结构和功能的完整性。酒精在肝脏的代谢产物乙醛在对肝细胞产生毒性的同时会与GSH、GSH-Px的巯基结合，加速GSH的耗竭，抑制GSH-Px活性，使内源性抗氧化能力下降，加重肝细胞氧化损伤〔11〕。因此检测肝组织GSH含量和GSH-Px活性也是衡量酒精性肝损伤时肝脏氧化应激及脂质过氧化程度的重要指标。脂质过氧化的代谢终产物MDA是氧化应激损伤的敏感指标，检测MDA含量可衡量细胞脂质过氧化损伤的程度〔12〕。

本研究结果说明酒精性肝损伤模型制备成功。酒精诱导大鼠肝脏出现氧化应激反应。益心酮能保护肝细胞，稳定细胞膜的结构和功能，对酒精性肝损伤有一定的保护作用。本研究表明益心酮具有较强的清除自由基抑制脂质过氧化反应的能力，能减少大鼠肝脏内GSH的消耗，增强内源性SOD、GSH-Px等抗氧化酶的抗氧化能力，抑制自由基介导的脂质过氧化反应对肝脏的损伤，对酒精性肝损伤有确切的保护作用。维生素E是一种公认的抗氧化剂，能清除自由基，提高内源性抗氧化酶活性，抑制酒精诱导的肝脏氧化应激损伤。本研究结果表明，益心酮和维生素E均能提高肝组织SOD、GSH-Px、GSH水平，降低MDA含量，而维生素E的保肝抗氧化能力优于益心酮。

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