碘对自身免疫性甲状腺疾病大鼠血清与甲状腺组织IP-10 mRNA表达的影响

高 瑛 刘胜凤 张成华

(川北医学院附属医院，四川 南充 637000)

碘对自身免疫性甲状腺疾病大鼠血清与甲状腺组织IP-10 mRNA表达的影响

高 瑛 刘胜凤 张成华1

(川北医学院附属医院，四川 南充 637000)

目的 探讨碘对自身免疫性甲状腺疾病大鼠血清与甲状腺组织IP-10 mRNA表达水平的影响。方法 选取4周龄的特殊清洁级(SPF)级雌性Wistar大鼠90只，按照随机数字法分为对照组(NC)、模型组(TG)、适碘组(NI)、模型组+适碘组(TG+NI)、高碘组(HI)、模型组+高碘组(TG+HI)，每组15只。剔除造模失败、死亡、瘦弱的大鼠，选择每组10只。NC组和TG组饮用不含碘的去离子水，NI组合TG+NI组饮用含150 μg/L碘的去离子水，HI组和TG+HI组饮用含3 000 μg/L碘的去离子水。在第10周结束时处死所有大鼠。放射免疫法(RIA)测定甲状腺自身抗体水平；分光光度计法测定大鼠组织碘和尿碘；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IP-10含量；RT-PCR法检测甲状腺组织IP-10 mRNA表达水平。结果 6组大鼠血清的TGAb和TMAb水平及甲状腺组织IP-10 mRNA水平组间比较均差异显著(P<0.05)，同等碘处理条件下，模型组的血清水平均显著高于非模型组(P<0.05)。6组大鼠的甲状腺组织碘和尿碘水平组间比较均有显著差异(P<0.05)，且随着碘摄入量的增高甲状腺组织碘及尿碘水平均显著升高(P<0.05)；同等碘处理条件下，所有模型组的甲状腺组织碘和尿碘水平均低于非模型组。而6组大鼠血清IP-10含量比较无显著差异(P>0.05)。结论 大鼠对碘过量具有很强的耐受能力，可以适应高碘现象，当碘过量时，会降低机体甲状腺组织重IP-10 mRNA的表达，以此提高高碘的耐受能力。

自身免疫性甲状腺炎；碘；IP-10

自身免疫性甲状腺疾病(AITD)属于一种非常常见的器官特异性的自身免疫性疾病，主要包括Graves眼病、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、产后甲状腺炎等〔1〕。AITD发病机制复杂并且与多种因素有关，不仅与自身机体的免疫因素、遗传因素、环境因素有关，还与因自由基导致的氧化应激等相关〔2〕。甲状腺激素由甲状腺合成分泌，其中碘作为该过程中的必需微量元素参与其中〔3〕。趋化因子是一类细胞因子，具有化学引诱物特性，能够引发大量免疫效应细胞进入炎症组织，起到启动和维持自身免疫过程的作用。近年来，越来越多研究人员关注趋化因子IP-10在发病过程中的作用，如肾炎、慢性乙肝、类风湿关节炎等〔4〕。本研究采用猪甲状腺球蛋白诱导大鼠形成实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)模型，观察碘量差异对大鼠血清IP-10水平及甲状腺IP-10 mRNA含量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取4周龄的特殊清洁级(SPF)级雌性Wistar大鼠90只，体重120～140 g，按照随机数字法分为对照组(NC)、模型组(TG)、适碘组(NI)、模型组+适碘组(TG+NI)、高碘组(HI)、模型组+高碘组(TG+HI)，每组15只。剔除造模失败、死亡、瘦弱的大鼠，选择每组10只。

1.2 动物饲养 根据美国营养学会(AIN)的啮齿类动物纯化配方的要求〔5〕，配制合成饲料对各组大鼠进行喂食(所有成分均按照配方要求进行配置，但是混合矿物质配置时不加碘)。NC组和TG组饮用不含碘的去离子水，NI组及TG+NI组饮用含150 μg/L碘的去离子水，HI组及TG+HI组饮用含3 000 μg/L碘的去离子水。

1.3 EAT动物模型 将100 mg猪甲状腺球蛋白完全溶于50 ml无菌双蒸水中，取10 ml溶解液分别与10 ml完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂混合形成浓度为200 μg/ml的油包水状乳剂抗原。实验第2周对大鼠进行初次免疫，在其右后足皮下注射0.5 ml乳剂抗原；实验第5周进行加强免疫，在其背部皮下注射0.5 ml乳剂抗原，每周注射1次，共注射6次，在第10周结束时处死所有大鼠。迅速取出甲状腺，测定组织含碘；死前1 w收集尿液进行尿碘测定。

1.4 EAT大鼠自身抗原检测 实验第10周所有大鼠眼静脉取血置于离心管，室温静止30 min后3 600 r/min离心10 min，分离血清，放射免疫法检测TGAb及TMAb，试剂盒均购于坊三维生物工程集团有限公司，设置阴性血清管、阳性血清管和样本管，所有管中均加入标记物，再加入免疫分离剂，离心去上清，测沉淀放射性计数，具体步骤参考说明书所述。

1.5 血清IP-10含量检测 实验第10周所有大鼠眼静脉取血置于离心管，室温静止30 min后3 600 r/min离心10 min，分离血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IP-10含量，试剂盒购于美国Peprotech公司，在酶标板孔内加入标准品和样品，450 nm处测定OD值，根据标准品做出标准曲线，计算样品浓度，具体步骤参考说明书所述。

1.6 甲状腺组织IP-10 mRNA检测 采用RT-PCR方法，实验第10周，解剖各组大鼠，从甲状腺组织中利用Trizol法提取总RNA，利用大连TAKARA公司的逆转录试剂盒合成cDNA。PCR引物序列：IP-10：正义：5′-CAAGGCTTCCCAATTCTC-3′，反义：5′-ACCTGGACTGCATTTGA-3′，退火温度57℃，长度202 bp；GAPDH：正义：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAATG-3′，反义：5′-ATGGTGGTGAACGCCAGTA-3′。退火温度57℃，长度143 bp。各组的mRNA相对表达量以2-△△CT值表示。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0软件，计量资料两组间比较采用t检验，多组间比较采用重复测量方差分析。

2 结 果

2.1 大鼠血清TGAb及TMAb水平 6组大鼠血清TGAb及TMAb水平组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，同等碘处理条件下，模型组的血清水平均显著高于非模型组(P<0.05)，见表1。

2.2 甲状腺组织碘及尿碘水平 6组大鼠的甲状腺组织碘和尿碘水平组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)；随着碘摄入量的增高，甲状腺组织碘及尿碘水平均显著升高(P<0.05)。同等碘处理条件下，模型组的水平均低于非模型组，见表1。

2.3 血清IP-10含量及甲状腺组织IP-10 mRNA水平 6组大鼠血清IP-10含量比较差异无统计学意义(P>0.05)，而甲状腺组织IP-10 mRNA水平差异有统计学意义，随着不断增加碘的摄入量，IP-10 mRNA表达水平均高于NC组；同等碘处理条件下，模型组的IP-10 mRNA的表达水平均高于非模型组(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血清TGAb、TMAb水平甲状腺组织碘、尿碘、血清IP-10含量及甲状腺组织IP-10 mRNA比较

与NC组比较：1)P<0.05；与TG组比较:2)P<0.05；与NI组比较:3)P<0.05；与HI组比较:4)P<0.05

3 讨 论

本试验采用的EAT模型，被认为是研究AITD的标准动物模型〔6〕。EAT大鼠模型成功建立的标准之一为血清中TMAb及TGAb含量较高。碘量摄入过多也能够增强TMAb及TGAb的免疫原性〔7〕。本实验中，模型组大鼠血清中TMAb及TGAb含量均高于正常对照组；此外，TMAb及TGAb升高促使甲状腺淋巴细胞浸润程度，加快穿孔素释放激活凋亡系统，最终加速凋亡、破坏滤泡上皮细胞。根据上述结果，我们可以认定实验模型造模成功。

NC和TG组喂养10 w后检测尿碘含量及甲状腺组织中碘的含量，表现出显著的碘缺乏。HI组虽然每天的摄入碘量是NI组的20倍，但是检测出的甲状腺组织碘的含量并未表现出成倍地增加，只是出现轻微的升高；却发现尿碘的含量成倍增加，增加幅度与摄入量较一致。表明甲状腺具有严格调控碘摄入的能力。

趋化因子是一类细胞因子，能够激发白细胞的趋化性，诱导单核、中性粒巨噬细胞等炎性细胞进入到炎症灶，增强炎性细胞在炎症过程中的吞噬杀伤能力，还能影响细胞因子在免疫系统中的作用〔8〕。根据功能和生成趋化因子的细胞类型，可将趋化因子分为4个亚族：C、CC、CXC、CX3C，其中C表示一个半胱氨酸，X表示氨基酸残基〔9〕。IP-10是CXC亚族中比较具有代表性的趋性因子，可由干扰素(IFN)-γ诱导产生，在炎症反应中IP-10能够结合CXCR3受体趋化活化诸多淋巴细胞迁移至炎症部位〔10〕。本实验中，不断增加碘的摄入量，大鼠血清中的IP-10水平与甲状腺中IP-10 mRNA表达水平均高于正常对照组，并且升高趋势一致。TG+NI组比正常碘给予组的甲状腺分泌了更多的IP-10。还有学者研究发现，血清中IP-10水平仅仅在刚被确诊为ETA的患者体内升高，如果患者属于长期患病，则其体内血清IP-10水平降低，反而出现另一种趋化因子CCL22水平升高〔11〕。从结果来看，当摄碘量高至一定浓度时，大鼠机体会发生代偿性紊乱，也可能因为ETA病情的加重，另一种趋化因子开始影响，这需要通过后续试验进行深入研究。

综上所述，大鼠对过量碘具有很强的耐受能力，可以适应高碘现象。其机制之可能为当碘过量时，会降低机体甲状腺组织IP-10 mRNA的表达，以此提高高碘的耐受能力。

1 房 方,卫红艳,王坤玲,等.硒治疗自身免疫性甲状腺疾病的荟萃分析〔J〕.国际内分泌代谢杂志,2016;36(4):570-2.

2 Effraimidis G,Wiersinga WM.Mechanisms in endocrinology:autoimmune thyroid disease:old and new players〔J〕.Eur J Endocrinol,2014;170(6):R241-52.

3 李 康,于健春,康维明.碘摄入与甲状腺疾病〔J〕.中华地方病学杂志,2016;35(3):166-9.

4 杨 璐,李恒平,刘振华,等.趋化因子与炎症、前列腺癌的关系的研究〔J〕.现代预防医学,2015;42(5):952-6.

5 Aguilar EG,Albarracín GD,Uates MA,etal.Evaluation of the nutritional quality of the grain protein of new amaranths varieties〔J〕.Plant Food Human Nutr,2015;70(1):21-6.

6 刘 丹,蔺新英,于福贵,等.海带有机碘与无机碘对甲状腺功能亢进Wistar大鼠心肌ATP酶的影响〔J〕.中华地方病学杂志,2015；34(9):646-9.

7 徐伟良,聂芙蓉,曹绮雯,等.血清甲状腺球蛋白抗体、甲状腺微粒体抗体、甲状腺过氧化物酶抗体对自身免疫性甲状腺疾病的诊断价值〔J〕.实用临床医药杂志,2014;18(5):10-2.

8 牟 娜,牟 佳,李 宁,等.慢性乙型肝炎患者外周血趋化因子和炎症因子的水平〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,2015;31(7):968-71.

9 罗雪雁,阳学风.趋化因子在肝纤维化中作用的研究进展〔J〕.中国肝脏病杂志电子版,2014;6(2):94-6.

10 Bolomsky A.CXCR3 binding chemokines MIG,IP-10 and ITAC are predictors of overall survival in newly diagnosed multiple myeloma〔J〕.Blood,2014;124:2052.

11 Grigore GE,Ivanov IC,Zlei M,etal.Specific associations between clinical signs,immune cells,disease genetic background and burden in a group of patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia〔J〕.Revista Romana de Medicina de Laborator,2014;22(1):79-92.

〔2016-11-19修回〕

(编辑 李相军)

Effect of iodine on the expression of IP-10 mRNA in serum and thyroid tissue of autoimmune rats

GAO Ying, LIU Sheng-Feng, ZHAGN Cheng-Hua.

Affiliated Hospital of Chuanbei Medical College, Nanchong 637000, Sichuan, China

Objective To investigate the effect of iodine on the expression of IP-10 mRNA in serum and thyroid tissue of autoimmune rats.Methods 90 SPF female Wistar rats were randomly divided into control (NC), model (TG), normal iodine (NI), model and normal iodine (TG+NI) and high iodine (HI), model and high iodine (TG+HI) groups, 15 cases each. NC and TG groups were given no iodine water, NI and TG+NI groups deionized water containing 150 g/L deionized water, HI and TG+HI groups water containing 3 000 g/L, NC and TG groups deionized water with out iodine, NI and TG+NI groups deionized water containing 150 μg/L of water, HI and TG+HI groups deionized water containing 3 000 μg/L. Radioimmunoassay (RIA) was used to determine the levels of thyroid autoantibodies; spectrophotometry was used to determine iodine and iodine in rat tissues; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine serum IP-10 content; RT-PCR method was used to detect the expression of IP-10 mRNA in thyroid tissue.Results The serum TGAb and TMAb levels and thyroid tissue IP-10 mRNA levels were significantly different between two groups (P<0.05); in the same iodine treatment conditions, serum TGAb and TMAb levels of all of the model groups were significantly higher than those of non model groups (P<0.05). The thyroid iodine and urinary iodine levels had significant differences(P<0.05); and with the increase of iodine intake, iodine of thyroid tissue and urinary iodine levels were significantly increased (P<0.05).Conclusions Rats have a strong tolerance to iodine excess, to adapt to the phenomenon of high iodine, when under excessive iodine, it will reduce the IP-10 mRNA expression of thyroid tissue, in order to improve the tolerance of high iodine.

Autoimmune thyroiditis; Iodine; IP-10

国家自然科学基金青年科学基金项目(No.21503026)

张成华(1985-)，女，博士，讲师，主要从事基础医学研究及教学工作。

高 瑛(1988-)，女，在读硕士，主要从事基础医学研究。

R581.4

A

1005-9202(2017)13-3135-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.006

1 川北医学院基础医学院