蜂毒肽对大鼠退行性骨关节病软骨细胞NF-κB信号通路的影响

汤发强 吴 宏 郑建章 胡世平 郭徽灵 颜来鹏 许春财 林蕴硕

(福建省立医院骨科，福建 福州 350001)

蜂毒肽对大鼠退行性骨关节病软骨细胞NF-κB信号通路的影响

汤发强 吴 宏 郑建章 胡世平 郭徽灵 颜来鹏 许春财 林蕴硕

(福建省立医院骨科，福建 福州 350001)

目的 探究蜂毒肽对大鼠退行性骨关节病软骨细胞核因子(NF)-κB信号通路的影响。方法 成功建立大鼠骨关节炎模型，分别于关节腔注射蜂毒肽，并体外分离慢性骨关节炎软骨细胞，采用体外增殖CCK8实验及实时定量聚合酶链反应(PCR)，观察蜂毒肽对软骨细胞的保护作用；采用Western印迹法分别检测了不同剂量下蜂毒肽影响白细胞介素(IL)-1诱导NF-κB信号通路的激活情况。结果 成功建立大鼠膝关节来源的体外软骨细胞培养体系后，经细胞增殖CCK8实验结果发现，与慢性骨关节炎组相比，慢性骨关节炎+蜂毒肽组膝关节软骨细胞的增殖能力最强；经实时定量PCR检测成骨关键分子〔成骨特异转录因子核心结合因子(Runx)2,碱性磷酸酶(ALP),成骨相关转录因子(Osterox)〕的表达结果显示，相比于慢性骨关节炎组，慢性骨关节炎+蜂毒肽组早期胚胎发育相关基因(Sox)9、CCAAT增强子结合蛋白(CEBP)2、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)因子表达均上调。经Western 印迹检测发现，随蜂毒肽浓度的逐渐增高，IL-1β诱导核因子(NF)-κB及I-κB的表达条带颜色逐渐递减，且随时间延长，降低程度逐渐明显。结论 蜂毒肽通过抑制NF-κB信号转导途径的激活以起到骨关节炎患者关节软骨保护。

蜂毒肽；慢性骨关节炎；核因子(NF)-κB

长期慢性炎症刺激所致关节软骨及滑膜损害、增生、融合是引起后续关节僵硬的重要因素〔1,2〕。蜂毒肽可促进肾上腺皮质激素及促进肾上腺皮质激素的释放，进而起到抵抗自身免疫等作用〔3〕。蜂毒肽症明显减轻兔的滑膜炎〔4〕。相比于吲哚美辛，蜂毒肽对前列腺素合成酶的抑制作用更强，约70倍，同时也具有良好的镇痛作用〔5〕。骨关节炎的发生发展是包括多种炎性介质、细胞因子、机械性应力等因素共同作用的结果。而各因素均通过刺激关节内细胞进而引起相应的病理效应〔6〕。刺激因素引起的病理效应，需要将信号经细胞传递至细胞内部。正是由于这些信号的密切配合，最后引起基因转录调控的变化。核因子(NF)-κB是参与炎症及免疫反应的一种中心转录因子，它可被包括：肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-1β等多细胞因子激活，进而快速诱导免疫炎症反应内多基因的表达，包括炎性酶、细胞因子及基质金属蛋白酶等〔7〕。同时在大鼠骨性关节炎模型中研究表明，软骨细胞中NF-κB信号转导途径被激活〔8〕。本研究旨在探讨NF-κB信号转导途径在蜂毒肽影响大鼠骨关节炎关节软骨细胞中的具体作用机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物 健康SD大鼠60只，常规饲料喂养。随机分为三组，每组20只，20只大鼠不做任何处理，作为对照组。其余大鼠切断膝关节内侧副韧带以建立关节炎模型，其中20只大鼠关节腔不注射任何药物为慢性骨关节炎组，余20只术后5 w后关节腔内开始注射3%蜂毒肽0.15 mg/kg为慢性骨关节炎+蜂毒肽组，每周重复注射1次，3组均于术后11 w处死。

1.2 实验试剂 蜂毒肽、IL-1β(南京肽业生物科技有限公司)，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒，超敏电化学发光(ECL)发光液；TRIZOL；逆转录试剂盒，聚合酶链反应(PCR)Taq酶Mix，PCR Marker；一氧化氮合酶多克隆抗体；β-actin多克隆抗体；链霉素和素-生物素复合物(SABC)试剂；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒等；I-κB、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、NF-κB引物及多克隆抗体。

1.3 软骨细胞原代培养 无菌条件下取5～7日龄SD大鼠双侧膝关节面软骨。切下的组织立即置于含双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗，并剪成约1 mm3后胰酶消化30 min后，滤网过滤收集细胞，1 000 r/min离心10 min去上清，20%胎牛血清的DMEM-F12培养基37℃、饱和湿度、CO2浓度5%培养。

1.4 蛋白质免疫印迹分析 原代软骨细胞培养于6孔板，Western印迹分别检测不同剂量下蜂毒肽影响IL-1诱导NF-κB信号通路的激活情况；1:(空白对照组)不加任何处理因素; 2:10 ng/L IL-1β;3:10 ng/L IL-1β+100 μg/ml蜂毒肽;4:10 ng/L IL-1β+200 μg/ml蜂毒肽;5:10 ng/L IL-1β+300 μg/ml蜂毒肽。每组设4个复孔，连续培养24 h进行检测，以加入IL-1β后检测的时间点30、60、120 min三个时间点，检测NF-κB的核转位及I-κB的降解。一抗(NF-κB浓度1∶500，I-κB浓度1∶400，iNOS浓度1∶250)，二抗稀释浓度1∶10 000，β-actin为内参。

1.5 总RNA的提取和实时定量PCR(qPCR) 细胞分组及处理方式同Western印迹法。提取总RNA反转录成cDNA，进行荧光定量PCR反应。反应条件：95℃预变性10 min(95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)×40循环，72℃末次延伸5 min。采用2-ΔCT法进行相对定量分析。

1.6 统计学方法 采用GRAPH PAD6.0统计软件进行t、χ2、F检验。

2 结 果

2.1 大鼠膝关节软骨细胞的分离与鉴定 原代培养首次换液后，贴壁细胞多为单个长梭形细胞，偶尔可见几个细胞的克隆，细胞在传代3次后，形态均一，呈长梭形，融合时呈漩涡状生长。阿尔辛蓝染色，细胞分泌的多聚糖染为蓝色，见图1。表明已成功建立大鼠膝关节来源的体外软骨细胞培养体系。

图1 成功分离并鉴定大鼠膝关节软骨细胞(×400)

2.2 Western印迹法检测不同剂量蜂毒肽影响IL-1诱导NF-κB信号通路的结果 随着蜂毒肽浓度的逐渐增高，IL-1β诱导NF-κB及I-κB的表达条带颜色逐渐递减，同时随时间的延长，降低程度逐渐明显(图2)。以上结果提示：蜂毒肽通过抑制NF-κB信号转导途径的激活以起到对骨关节炎关节软骨细胞的保护作用。

1:空白对照组；2：10 ng/L IL-1β；3：10 ng/L IL-1β+100 μg/ml 蜂毒肽；4：10 ng/L IL-1β+200 μg/ml蜂毒肽；5：10 ng/L IL-1β+300 μg/ml蜂毒肽图2 蜂毒肽通过抑制NF-κB信号转导途径的激活保护骨关节炎关节软骨细胞

2.3 细胞增殖CCK8实验法和实时定量PCR法检测结果 细胞增殖CCK8实验显示，与慢性骨关节炎组相比，慢性骨关节炎+蜂毒肽组膝关节软骨细胞的增殖能力明显增高(P<0.05),见表1。实时定量PCR检测成骨关键分子〔成骨特异转录因子核心结合因子(Runx)2、碱性磷酸酶(ALP)、成骨相关转录因子(Osterox)〕表达，相比于慢性骨关节炎组，慢性骨关节炎+蜂毒肽组早期胚胎发育相关基因(Sox)9上调(2.4±0.7)倍，CCAAT增强结合蛋白(CEBP)2上调(1.5±0.4)倍，聚集蛋白聚糖(Aggrecan)上调(1.9±0.2)倍，均差异显著(P<0.05)，见表2。蜂毒肽可通过提高慢性骨关节炎软骨细胞的增殖及软骨特性维持，以起到对大鼠膝关节软骨细胞的保护作用。

表1 CCK8实验检测各组培养24、48、72 h软骨细胞增殖率(n=20，%)

1)慢性骨关节炎+蜂毒肽组与慢性骨关节炎组比较；表2同

表2 实时定量PCR检测各组软骨细胞特异性转录分子的表达

3 讨 论

蜂毒肽也称蜂毒溶血肽或蜂毒素。蜂毒肽具有良好的药物活性，研究提示蜂毒肽有较好的溶血和抗菌作用。其次，还可通过选择性抑制N-胆碱受体，以阻滞神经冲动的传导〔9〕。炎症反应是骨关节炎发生与发展的基础病理因素，其发生发展是多刺激因素共同作用的结果。而各因素均通过刺激关节内细胞进而引起相应的病理效应的。NF-κB作为免疫炎症反应的重要转录因子之一，在骨关节炎的发病中起极其重要的作用。因此，通过抑制NF-κB途径以阻抗骨关节炎的发展，是目前干预骨关节炎的新方向〔10〕。NF-κB作为免疫炎症反应中的一重要转录因子，可多种基因的启动子或增强子结合，从而促进基因转录。NF-κB存在于所有哺乳动物细胞内。研究显示，作为NF-κB一重要成员，在骨关节炎滑膜炎(OA)和类风湿关节炎(RA)中，NF-κBp50和p65表达均增加〔11〕。并且RA比OA中NF-κB的激活更高。在脊柱关节病(SPA)及RA患者滑膜组织的研究中表明，NF-κB高表达于软骨-血管翳交界处〔12〕。此外，正常大鼠关节内转入IKKβ基因可引起关节炎，表现关节严重肿胀，炎性病理变化及IKK的活性增加，NF-κB的DNA结合活性增强。提示NF-κB在慢性骨关节炎的发病过程中扮演了重要的角色。

NF-κB可影响软骨细胞功能。在关节软骨细胞中研究发现，IL-1β和TNF-α均可引起NF-κB的活化，而TNF-α和IL-1β联合刺激关节软骨细胞对NF-κB的活化起到协同作用〔13〕。用各种特定的抑制剂抑制NF-κB途径，进一步延缓及扼制炎症反应的发展，可能是一个潜在的治疗策略。本文结果显示蜂毒肽可通过提高慢性骨关节炎软骨细胞的增殖及软骨特性维持，以起到对大鼠膝关节软骨细胞的保护作用。蜂毒肽通过抑制NF-κB信号转导途径的激活以起到骨关节炎关节软骨细胞的保护作用。

1 杨文超，吴珍红，缪晓青.蜂毒肽和神蜂精体外抗HSV-1病毒作用研究〔J〕.中国蜂业，2010；61(4)：14-5.

2 严序炳.蜂毒注射液治疗风湿性及类风湿性关节炎86例〔J〕.中国中西医结合杂志，1995；15(6)：370.

3 陈素霞，孙学军，李顺子，等.蜂毒肽C末端片段的反序肽的抗菌活性和溶血活性〔J〕.高等学校化学学报，2005；26(12)：2233-6.

4 李亚非，时述山，李 欣.纯化蜂毒肽对兔免疫性关节炎的抑制作用〔J〕.中华风湿病学杂志,2000;4(5):293-5.

5 Parasadam I,van Gennip S,Friis T,etal.ERK-1/2 and p38 in the regulation of hypertrophic changes of normal articular cartilage chondrocytes induced by osteoarthritics subehondral osteoblasts〔J〕.Arthr Rheum，2010；62(5)：1349-60.

6 Rasheed Z，Akhtar N，Haqqi TM.Pomegranate extract inhibits the interleukin-l beta-induced actiwation of MKK-3，p38 alpha-MAPK and transcuiption factor Runx-2 in human osteoarthritis chondrocytes〔J〕.Aitihr Res Therapy，2010；12(5)：195.

7 Frondoza CG，Heinecke LF，Grzanna MW，etal.Inhibition of cytokine induced prostaglandin E2 production and NF-kappa-B activation in arcticular chondrocytes by abocado/soyben unsaponiflables and glcosanmine〔J〕.Osteoarth Cartil，2010；18(2)：S206.

8 张亚峰，王骏飞，陈东阳.核因子κB信号转导途径在大鼠实验性骨性关节炎软骨细胞中被激活〔J〕.中国组织工程研究,2006;10(37):71-3.

9 Udalova IA，Mott R，Field D，etal.Quantitative prediction of NF-κB DNA eprotein interactions〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2002;99：8167-72.

10 Koop A，Lepenies I，Braum O，etal.Novel splice variants of human IKK epsilon negatively regulate IKK epsilon-induced IRF3 and NF-κB activation〔J〕. Eur J Immunol，2011；41(1)：224-34.

11 Reuter S，Prasad S，Phromnoi K，etal.Thiocolchicoside exhibits anticancer effects through downregulation of NF-κB pathway and its regulated gene products linked to inflammation and cancer〔J〕.Cancer Prev Res，2010；3(11)：1462-72.

12 Schmidt N，Pautz A，Art J，etal.Transcriptional and post-transcriptional regulation of iNOS expression in hunman chondrocytes〔J〕.Biochem Pharmacol，2010；79(5)：722-32.

13 Kim SJ，Park JH，Kim KH，etal.Effect of NF-kappa B decoy oligodeoxy-nucleotide on LPS/high-fat diet-induced atheroselerosis in an animal model〔J〕.Basic Clin Pharmacol Toxieol，2010；107(6)：925-30.

〔2016-03-19修回〕

(编辑 苑云杰)

福建省自然科学基金计划项目(No.2015J01429)

汤发强(1972-)，男，博士在读，副主任医师，主要从事关节疾病研究。

R365.2

A

1005-9202(2017)13-3132-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.005