老年性聋小鼠认知功能的下降及其机制

方仪德 何祖燕 陈 丹 陈圣敏 楚 敏 隋 璐 董 杨

(上海中医药大学教学实验中心，上海 201203)

老年性聋小鼠认知功能的下降及其机制

方仪德 何祖燕 陈 丹 陈圣敏 楚 敏 隋 璐 董 杨

(上海中医药大学教学实验中心，上海 201203)

目的 观察C57BL/6J老年性聋小鼠认知功能的改变并探讨其机制。方法 雄性C57BL/6J小鼠分为3月龄(青年)组和12月龄(中年)组。听性脑干反应(ABR)检测小鼠听功能，Morris水迷宫观察小鼠的空间学习和记忆能力，Western印迹检测小鼠海马和听皮层BDNF和p-TrkB的蛋白表达。结果 12月龄小鼠8、16、24 kHz和32 kHz的听阈值与3月龄组比较明显上升(P<0.01)，提示听功能严重损失。Morris水迷宫实验结果显示，从训练的第3天开始直到第5天，12月龄组小鼠潜伏期均显著高于3月龄组(P<0.01,P<0.05)，12月龄组小鼠穿越平台次数显著低于3月龄组(P<0.01)。Western印迹结果发现，与3月龄小鼠比较，12月龄小鼠海马和听皮层BDNF蛋白表达无明显变化，p-TrkB蛋白表达降低。结论 12月龄C57BL/6J小鼠即显示明显的认知功能下降，可能与其早发的老年性聋有一定关系，海马和听皮层TrkB蛋白的磷酸化可能是主要机制之一。

老年性聋;认知功能;海马;听皮层

大量临床观察表明，听力损失的患者更容易发展成为阿尔茨海默病(AD)或者其他类型的老年痴呆。有研究报道，痴呆者比非痴呆者的听力障碍更多见，二者不仅相关，听力下降程度与认知障碍程度之间还存在着明显的正相关，即听力障碍越重，认知障碍越重，使用助听器能够使认知功能障碍改善〔1,2〕。Gates等〔3〕在进行了大规模的临床前瞻队列研究后指出，中枢听觉言语处理障碍中47%发展为AD失智型，而对照组中只4.6%，认为听力障碍可能是AD的早期症状。有学者在老年性聋模型C57BL/6J小鼠观察到年龄相关的听力损失伴随空间学习记忆能力的下降以及海马CA3区突触的退化，而无老年性聋的小鼠模型CBA/CaJ则无此特征〔4〕。虽然老年性聋与认知功能障碍或老年痴呆等疾病相关的机制尚不清楚，但二者的关联已经被大量临床研究证明确实存在，听力障碍可以作为预测随访期间认知功能是否下降的指标，而对老年人听力损失进行早期干预有可能延缓老年痴呆的发生〔5,6〕。因此，探讨老年性聋与认知功能下降的关系及其机制有一定的临床指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性C57BL/6J小鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。

1.1.2 实验仪器 TDT-Ⅲ系统：美国Tucker-Davis-technologies公司； Ethovision XT动物轨迹跟踪及行为观察记录分析系统：荷兰Noldus information technology公司；水平、垂直电泳及转膜装置：美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 听性脑干反应(ABR) 记录电极置于小鼠的颅顶，参考电极置于刺激侧耳廓，地线接对侧耳廓。采用TDT-Ⅲ系统测试，刺激声为8,16,24，32 kHz的短纯音，声刺激从90 dB开始，5 dB递减，以能分辨出ABR波形的刺激强度确定阈值。

1.2.2 Morris水迷宫 Morris水迷宫实验分为定位航行和空间探索两部分。将水迷宫均分为4个象限，实验训练阶段为5 d。每只小鼠每天接受2次训练，每次60 s，两次训练间隔为30 s。如果小鼠在60 s内上台，则允许其在平台停留30 s。如果小鼠在60 s内不能找到平台，则将其引导至平台并使其停留30 s，其潜伏期即为60 s(定位航行实验)。实验第6天撤除平台，分2次将小鼠放入水中，游泳时间60 s，记录并分析小鼠穿越原平台位置的次数(空间探索实验)。

1.2.3 Western印迹 组织按照每20 mg/100 μl的比例加入裂解液，充分裂解后，离心，取上清。BCA法测蛋白浓度。样品按40 μg样品蛋白/孔上样，12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转75 min(4℃，100 V)，5%脱脂奶粉室温平摇封闭2 h，然后分别用GAPDH(1∶2 000)、BDNF(1∶200)和p-TrkB(1∶500)一抗4℃平摇过夜，HRP标记二抗(1∶2 000)避光孵育2 h，采用ECL Plus显色液显色。

1.3 统计学分析 采用PrismDemo5.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 听功能损伤 采用ABR检测听功能，见图1。实验结果表明，12月龄小鼠8 kHz、16 kHz、24 kHz和32 kHz 的听阈值与3月龄组比较均有明显升高(P<0.01)，提示12月龄中年小鼠已经产生严重的听功能损失。

与3月龄比较：1)P<0.01图1 ABR检测听功能

2.2 空间和学习记忆能力下降 实验过程包括5 d的定位航行训练和1 d的空间探索实验，小鼠游泳轨迹见图2A。定位航行实验结果表明，从训练的第3天开始，3月龄小鼠的潜伏期即有显著的下降，而12月龄小鼠在5 d的训练过程中潜伏期没有明显变化。第3～5天，12月龄小鼠的潜伏期明显高于3月龄小鼠(P<0.01,P<0.05)，见图2B。经过5 d的训练后撤掉平台，进行空间探索实验。结果显示，12月龄组小鼠穿越平台次数(0.1±0.2)明显低于3月龄组(0.8±0.2，P<0.01)。见图2。

与3月龄组比较：1) P<0.01,2) P<0.05；(A)游泳轨迹图；(B)潜伏期图2 Morris水迷宫实验

2.3 蛋白表达变化 12月龄组小鼠海马和听皮层p-TrkB蛋白表达均低于3月龄组，提示与3月龄小鼠比较，12月龄小鼠TrkB蛋白磷酸化水平降低。两组小鼠海马和听皮层BDNF表达均无明显差异。见图3。

图3 Western印迹检测蛋白表达

3 讨 论

本研究发现老年性聋模型小鼠C57BL/6J在12月龄中年期即发生了明显的认知功能下降，这可能与其早发的听力损失有关。有报道，无早发型老年性聋的CBA/CaJ小鼠，在18个月仍能保持较好的学习和记忆功能，从另一个方面证明了认知功能的下降与听力损失可能存在某种联系〔7〕。而对于听功能是如何影响认知功能的，目前尚不十分清楚。有研究表明，对于听功能丧失的补偿可能引起与痴呆相关的神经血管和神经生理学改变，进而引起认知功能的下降〔8〕。还有学者认为，老年性聋可以引起皮层改变，进而影响与老年痴呆相关的脑区发生病理改变〔6,9〕。

听皮层是听觉通路的高级中枢，听皮层的功能异常和病理改变是老年性聋的重要发病机制之一〔10,11〕。海马是反映认知功能的主要脑区，与学习记忆能力密切相关。神经解剖学研究发现，听觉信息到达海马的通路主要有两条：丘脑投射系统从耳蜗神经核团经过内膝体到上橄榄核、中脑隔核、听皮层，这条通路经皮层联合区域进入内嗅区，到达海马；由耳蜗神经核经非丘脑通路、脑干网状结构、隔核进入海马〔12〕。还有研究表明，海马CA1区与听皮层存在直接的神经联系〔13〕。因此，海马和听皮层是研究老年性聋与认知功能障碍关系必不可少的部位。BDNF即脑源性神经营养因子，是在脑内合成的一种蛋白质，广泛分布于中枢和外周神经系统，在神经元的存活、分化、生长发育中起重要作用，与学习记忆功能及AD等疾病密切相关，通常与TrkB蛋白相结合产生作用〔14～16〕。TrkB是一种在脑组织中表达很高的蛋白激酶，是BDNF的受体，对于神经发展的突触功能有重要作用〔17〕。研究表明，AD脑组织中TrkB表达显著下降〔18〕。BDNF/TrkB通路在认知功能及AD的作用已经得到证实〔19〕，但在听觉系统中的作用尚未见报道。本研究结果提示TrkB蛋白磷酸化抑制可能参与C57BL/6J小鼠听功能和认知功能下降。BDNF 自身表达无明显变化，可能机制是BDNF通过结合TrkB，使TrkB磷酸化，其磷酸化位点募集下游效应因子，从而激活下游信号通路〔20〕。

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2 Castiglione A,Benatti A,Velardita C,etal.Aging,cognitive decline and hearing loss:effects of auditory rehabilitation and training with hearing aids and cochlear implants on cognitive function and depression among older adults〔J〕.Audiol Neurootol,2016;21(1):21-8.

3 Gates GA,Beiser A,Rees TS,etal.Central auditory dysfunction may precede the onset of clinical dementia in people with probable Alzheimer′s disease〔J〕.J Am Geriatr Soc,2002;50(3):482-8.

4 Yu YF,Zhai F,Dai CF,etal.The relationship between age-related hearing loss and synaptic changes in the hippocampus of C57BL/6J mice〔J〕.Exp Gerontol,2011;46(9):716-72.

5 Wayne RV,Johnsrude IS.A review of causal mechanisms underlying the link between age-related hearing loss and cognitive decline〔J〕.Ageing Res Rev,2015;23(Pt B):154-66.

6 Fortunato S,Forli F,Guglielmi V,etal.A review of new insights on the association between hearing loss and cognitive decline in ageing〔J〕.Acta Otorhinolaryngol Ital,2016;36(3):155-66.

7 Bielefeld EC,Tanaka C,Chen GD,etal.Age-related hearing loss:is it a preventable condition〔J〕.Hear Res,2010;264(1-2):98-107.

8 Wong PC,Jin JX,Gunasekera GM,etal.Aging and cortical mechanisms of speech perception in noise〔J〕.Neuropsychologia,2009;47(3):693-703.

9 Meredith MA,Keniston LP,Allman BL.Multisensory dysfunction accompanies crossmodal plasticity following adult hearing impairment〔J〕.Neuroscience,2012;214(1):136-48.

10 Gröschel M,Hubert N,Müller S,etal.Age-dependent changes of calcium related activity in the central auditory pathway〔J〕.Exp Gerontol,2014;58(1):235-43.

11 Zhong Y,Hu Y,Peng W,etal.Age-related decline of the cytochrome c oxidase subunit expression in the auditory cortex of the mimetic aging rat model associated with the common deletion〔J〕.Hear Res,2012;294(1-2):40-8.

12 Moxon KA，Gerhardt GA，Bickford PC，etal.Multiple single units and population responses during inhibitory gating of hippocampal auditory response in freely moving rats〔J〕.Brain Res,1999;825(1-2):75-85.

13 Cenquizca LA,Swanson LW.Spatial organization of direct hippocampal field CA1 axonal projections to the rest of the cerebral cortex〔J〕.Brain Res Rev,2007;56(1):1-26.

14 Poo MM.Neurotrophins as synaptic modulators〔J〕.Nat Rev Neurosci,2001;2(1):24-32.

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16 Fumagalli F,Racagni G,Riva MA.The expanding role of BDNF:a therapeutic target for Alzheimer′s disease〔J〕.Pharmacogenomics J,2006;6(1):8-15.

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18 Ginsberg SD,Che S,Wuu J,etal.Down regulation of trk but not p75NTR gene expression in single cholinergic basal forebrain neurons mark the progression of Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurochem,2014;97(2):475-87.

19 Zhang F,Kang Z,Li W,etal.Roles of brain-derived neurotrophic factor/tropomyosin-related kinase B(BDNF/TrkB) signalling in Alzheimer′s disease〔J〕.J Clin Neurosci,2012;19(7):946-9.

20 Lai KO,Wong AS,Cheung MC,etal.TrkB phosphorylation by Cdk5 is required for activity-dependent structural plasticity and spatial memory〔J〕.Nat Neurosci,2012;15(11):1506-15.

〔2017-01-13修回〕

(编辑 李相军)

Mechanisms of cognitive function decline of the presbycusis mice model

FANG Yi-De, HE Zu-Yan, CHEN Dan,etal.

Experimental Teaching Center, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Objective To observe the cognitive function decline and the mechanisms of presbycusis mice model.Methods The male C57BL/6J mice aged 3 months (young) and 12 months (middle-aged) were used. Auditory brainstem response (ABR) was used to test the hearing function. Morris water maze was used to examine the spatial learning and memory. Western blot was used to examine the BDNF and p-TrkB protein expression.Results ABR showed that the hearing threshold levels of 12 months old mice at 8,16,24 and 32 kHz were higher than those of 3 months old mice (P<0.01). The hidden platform test showed that the latency of 12 months old group was higher than that of 3 months old group from the third training day to the fifth training day (P<0.01, P<0.05). In probe test, the numbers of platform location crossing in 12 months old group increased significantly compared to that of 3 months old group (P<0.05). Western blot showed that the expression levels of p-TrkB in 12 months old group decreased significantly compared to 3 months old group. The expression of BDNF had no difference between two groups.Conclusions The significant cognitive decline is found in C57BL/6J mice, which might be related to the early onset of presbycusis. The phosphorylation of TrkB in hippocampus and auditory cortex might be one of the mechanisms.

Presbycusis; Cognitive decline; Hippocampus; Auditory cortex

国家自然科学基金资助项目(81102695)；上海市教委科研创新项目(14YZ064)

董 杨(1980-)，女，副教授，主要从事中医药防治老年病的研究。

方仪德(1996-)，男，中西医结合临床医学本科生，主要从事中西医结合学研究。

R764.4；R592

A

1005-9202(2017)13-3124-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.002