双孔钾离子通道TRAAK在膀胱炎大鼠脊髓中的表达变化

吴喜链 董忠 吴锦标 谢骐同 甘妙平

·实验研究·

双孔钾离子通道TRAAK在膀胱炎大鼠脊髓中的表达变化

吴喜链 董忠 吴锦标 谢骐同 甘妙平

目的 观察大鼠膀胱炎症模型L6～S1脊髓节段中TRAAK 钾离子通道的表达变化情况, 并探讨其与膀胱功能障碍的关系。方法 16只SD大鼠, 随机分为实验组及对照组, 每组8只。实验组给予环磷酰胺300 mg/kg一次性腹腔注射给药, 对照组则腹腔注射等量生理盐水。采集L6～S1脊髓节段组织, 利用免疫组织化学及western blot方法检测L6～S1脊髓节段TRAAK的表达。结果 免疫组织化学结果显示, 实验组大鼠L6～S1脊髓节段的前角及后角神经元染色均低于对照组, 差异有统计学意义(P＜0.05)。western blot结果提示, TRAAK钾离子通道在实验组大鼠L6～S1脊髓节段的蛋白表达量明显低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 TRAAK钾离子通道在大鼠膀胱炎症模型的L6～S1脊髓节段中表达下调, 这可能使脊髓神经中枢神经元的兴奋性升高, 进而参与膀胱炎症时膀胱功能障碍的发生。

膀胱炎；脊髓；TRAAK；大鼠

以尿频、尿急、尿痛为主要临床症状的膀胱炎症性疾病在临床上极为常见, 包括细菌性及非细菌性炎症, 而非细菌性膀胱炎的发病机制未明, 其治疗仍困扰着临床医生。膀胱的主要功能是储存尿液, 受脊髓排尿中枢的调控, 当膀胱出现炎症时, 膀胱的敏感性升高, 支配膀胱的脊髓排尿中枢的神经元兴奋性可能发生改变。双孔钾离子通道TRAAK (TWIK-related arachidonic acid-activated K channel, KCNK4)在生理条件下可以降低细胞兴奋性［1］, 可能是神经元兴奋性的调节器［2］。本文通过膀胱炎症大鼠, 采用免疫组织化学及蛋白质印迹的方法, 检测排尿中枢L6～S1脊髓节段的TRAAK表达变化情况, 从而探讨双孔钾离子通道与膀胱炎症之间的可能关系。

1 材料与方法

1. 1 材料来源 健康成年雌性Sprague Dawley 大鼠16 只,体重240～300 g, 购自中山大学实验动物中心。将SD大鼠随机分为实验组及对照组, 每组8只。

1. 2 方法 建模方法参照都书琪等［3］报道, 实验组每只均予环磷酰胺300 mg/kg一次性腹腔注射给药, 而对照组则腹腔注射等量生理盐水。注射48 h后乌拉坦腹腔内注射麻醉大鼠, 摘除膀胱备HE染色用, 同时切取T12椎体以下脊柱,由L6～S1脊神经根往上追溯确定L6～S1脊髓节段的位置。

1. 3 免疫组织化学及western blot检测L6～S1脊髓节段TRAAK的表达 免疫组织化学过程：将切取的脊髓节段经4%多聚甲醛溶液中固定24 h后进行梯度脱水、石蜡包埋、切片。病理切片常规脱蜡入水, 0.3% H2O2阻断内源性过氧化物酶, 山羊血清封闭切片, 滴加一抗, 4℃过夜；PBS 水洗后滴加二抗, DAB 显色, 苏木精复染胞核, 脱水, 透明, 封片,显微镜观察。western blot过程：将切取的脊髓节段称重, 组织匀浆, 提取蛋白, BCA法蛋白定量。进行SDS-PAGE凝胶电泳, 配制5%的浓缩胶及12%的分离胶, 分别用80 V及120 V进行电泳, 蛋白上样量100 μg, 转膜(200 A, 50 min), 5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 加入1∶2000 稀释的一抗4 ℃孵育过夜, 加入1∶5000 稀释的HRP 标记的二抗摇床上室温孵育1 h, 用化学发光法经X光底片成像显影。采用Gel-Pro analyzer 4软件对显影条带进行分析, 用目的条带和β-actin条带的IOD比值作为目的蛋白的相对表达水平。β-actin及TRAAK抗体均购自以色列Alomone公司。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

经腹腔内注射环磷酰胺48 h后, 大鼠膀胱可见充血、水肿, HE染色证实膀胱炎性改变。免疫组织化学显示TRAAK钾离子通道蛋白染色后呈褐色, 在L6～S1脊髓节段中, 两组大鼠的神经元均有TRAAK 钾离子通道蛋白表达, 细胞膜及细胞质中均被染成褐色。与对照组相比, 实验组大鼠的脊髓后角及前角神经元染色较浅, 差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1 A, B。在TRAAK 钾离子通道蛋白起作用的细胞膜处, 对照组大鼠的神经元的染色较实验组更深。见图1 C, D。这些提示炎症发生后TRAAK 钾离子通道表达下调。同时western blot 结果也提示了TRAAK 钾离子通道在实验组大鼠L6～S1脊髓节段中的蛋白表达下降。两组大鼠均有47 kD 的TRAAK钾离子通道蛋白表达, 但与对照组相比, 实验组的条带密度相对较低, 差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图1 TRAAK钾离子通道在两组L6~S1脊髓节段中表达情况的免疫组织化学结果

图2 TRAAK 钾离子通道蛋白在两组大鼠L6~S1脊髓节段中表达情况的western blot结果

3 讨论

膀胱炎在临床上表现为尿频、尿急等症状, 其产生的机制尚未明确。膀胱炎症状态下膀胱壁出现上皮损伤、黏膜水肿、肌层和黏膜层炎症细胞浸润等改变, 有研究发现大鼠膀胱炎模型的脊髓后根神经节中受体电位蛋白通道A1表达上调, 可能与膀胱炎时的病理性排尿有关［3］。可见, 膀胱炎症状产生的机制可能同时存在于膀胱壁、支配膀胱的神经纤维甚至神经中枢等。

膀胱的生理功能主要是在神经系统的支配下完成的, 包括膀胱充盈时的感知和排尿时逼尿肌的收缩等。当支配膀胱的神经系统发现病变, 比如神经元兴奋性改变, 均可能会引起膀胱功能障碍。另外, 人体中存在中枢致敏现象, 在外周伤害性刺激的重复或持续作用下, 神经突触兴奋性的功能依赖性变化可使伤害感受性系统发生敏感化［4,5］。膀胱炎性病变可产生强烈而持续的伤害性刺激, 也可能会使中枢神经产生病理生理改变。因此, 在膀胱炎症状态下对支配膀胱的脊髓排尿中枢中TRAAK 钾离子通道的表达情况进行研究。

大鼠腹腔注射环磷酰胺后, 在体内产生的代谢产物经由肾脏排泄, 进入膀胱后产生刺激作用, 使膀胱出现炎性反应,这是一个常用的炎性模型［3］。大鼠膀胱的中枢神经系统位于L6～S1脊髓节段, 本研究发现膀胱炎大鼠的L6～S1脊髓节段中的TRAAK 钾离子通道表达下降。

TRAAK 钾离子通道是属于TREK 类花生四烯酸敏感和机械牵张门控的双孔钾离子通道, 可产生自发的细胞背景电流, 维持一定的细胞膜静息电位, 其开放可引起细胞超极化、降低膜电位、减少钙离子内流、降低细胞兴奋性［1］, 可能是神经元兴奋性的调节器［2］。花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸等多不饱和脂肪酸对其有强烈地可逆性激活作用［6,7］, 而L-甲硫氨酸则可使花生四烯酸激活下的TREK 类钾离子通道开放几率下降。本研究中TRAAK 钾离子通道在膀胱炎症大鼠的L6～S1脊髓节段中表达下调, 推测可能存在以下原因：由炎症作用于膀胱壁的伤害感受器, 在尿液充盈膀胱时更为明显,产生的伤害性刺激信号传入脊髓神经中枢, 为了对抗膀胱的充盈状态, 减少伤害性刺激, 出现了TRAAK 钾离子通道的表达下降, 细胞膜静息电位上升, 神经元的兴奋性增高, 进而加强逼尿肌的收缩活动, 排空膀胱, 减少伤害性刺激, 这或许是神经系统的代偿反应之一［8-10］。

临床上膀胱炎包括细菌性和非细菌性炎症, 细菌性膀胱炎以抗感染对因治疗为主, 而非细菌性膀胱炎的治疗往往病因复杂而难以准确的进行对因治疗, 此时对症治疗就显得极为重要。本研究发现膀胱炎症大鼠脊髓排尿中枢的TRAAK表达下降, 可能引起脊髓后角的感觉神经元兴奋性升高, 可表现为尿急；而脊髓前角的运动神经元兴奋性升高则可表现为尿频。这符合膀胱炎的临床症状, 可为研究膀胱炎症所致膀胱功能障碍提供新的研究思路。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.12.111

2017-04-11］

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