基于三维打印和组织工程技术构建人阴茎形态软骨支撑体

袁兆远 宁进 陈洁 夏会堂 陶然 周广东 肖开颜 曹谊林

·论著·

基于三维打印和组织工程技术构建人阴茎形态软骨支撑体

袁兆远 宁进 陈洁 夏会堂 陶然 周广东 肖开颜 曹谊林

目的探讨基于三维打印和组织工程技术构建人阴茎形态软骨支撑体的可行性。方法应用三维打印技术制备人阴茎形态聚己内酯/羟基磷灰石（PCL/HA）内核，并在外层包被聚羟基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）细胞支架，组装成人阴茎形态三维复合支架。获取乳猪关节软骨细胞，培养、扩增至第1代，收取细胞，接种至复合支架，体外培养4周后植入裸鼠皮下，体内8周后取材，进行大体及组织学观察。结果人阴茎形态复合支架形态逼真，植入裸鼠体内8周后，再生出人阴茎形态的软骨支撑体，支撑体表面形成均质、成熟的软骨层，软骨层与内核支架融合良好。结论基于三维打印和组织工程技术，可形成内核为PCL/HA支架，外层包被成熟软骨的人阴茎形态软骨支撑体。

组织工程三维打印复合支架阴茎软骨

阴茎是男性重要的泌尿、生殖器官，具有排尿、排精和性交功能。因先天性畸形或创伤、肿瘤等导致的部分或完全缺损，使患者丧失排尿、性交能力的同时，给患者带来沉重的心理伤害[1]。阴茎缺损的治疗主要是阴茎再造术，皮瓣包裹软骨支撑体是基本的方法，合适的阴茎支撑体是决定手术成败的关键因素之一。阴茎支撑体主要有两大类：自体软骨或骨，以及人工阴茎假体[2-4]。自体软骨或骨移植，破坏供区解剖结构，甚至可引起供区功能障碍；而由惰性材料制成的人工假体，则存在免疫排斥、生物相容性差等问题。组织工程的快速发展为临床阴茎再造提供了新的思路[5]。

各类软骨缺损（如关节、气管等）的组织工程修复技术均已在动物体内获得了初步成功[6-7]，其中关节软骨缺损修复已实现了初步的临床转化[8]。因此，本研究尝试以组织工程技术，并辅以三维打印技术，构建阴茎形态软骨支撑体，为临床阴茎再造提供更为合适的软骨支持体。

聚羟基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）是软骨构建常用的细胞支架材料[9-11]，但是其力学强度不足，难以满足阴茎软骨支撑体对强度的需求；构建大体积的软骨还会出现中心部分营养不足，难以形成成熟软骨。聚己内酯（PCL）具有良好的组织相容性，力学强度高，并可调整，易塑形，可进行三维打印。但是，PCL缺乏细胞亲和位点，限制了其作为细胞支架的应用[12-15]。我们利用PGA/PLA的成软骨优势和PCL高强度、易塑形的特点，制作组装成内部为三维打印的阴茎形态PCL/HA内核（混入HA用以调整、维持材料强度），外部包被预先塑形的薄层多孔PGA/ PLA细胞支架，并尝试以此构建人阴茎软骨支撑体。

1 材料和方法

1.1 实验动物

5只雌性裸鼠（上海甲干生物科技有限公司）。实验过程中均依照实验动物保护指南的要求进行。

1.2 实验材料及设备

高糖DMEM培养基（Gibco公司，美国）；胎牛血清，磷酸盐缓冲液，胰蛋白酶（Hyclone公司，美国）；Ⅱ型胶原酶（Worthington公司，美国）；无纺PGA纤维（组织工程国家工程研究中心）；聚乳酸（PLA，济南岱罡生物工程有限公司）；聚己内酯（PCL）/羟基磷灰石（HA）复合材料（上海交通大学材料学院）；硅橡胶（3M公司，美国）。

三维打印熔融喷丝双喷头成型机（上海富奇凡机电科技有限公司）；混料机（Plastograph EC，Brabender公司，德国）。

1.3 原代细胞的获取及扩增

软骨取自新生乳猪髋、膝关节，将软骨块剪碎，加入0.25%Ⅱ型胶原酶，37℃震荡消化7～8 h，用100 μm细胞滤网过滤，离心，去上清液。沉淀的细胞用高糖DMEM培养基重悬，以1×104cells/cm2的浓度接种于100 mm培养皿上。在37℃、5%CO2及饱和湿度下，用含10%胎牛血清、2 ng/mL bFGF、1%青霉素及链霉素的DMEM培养基进行软骨细胞培养、扩增，待细胞生长至70%～80%融合时进行传代。

1.4 阴茎内核支架的打印

首先，CT扫描得到成年男性阴茎勃起状态下的三维数据，应用三维打印技术，将PCL/HA（7∶3）打印成多孔道的人阴茎形态内核支架。

1.5 模具制备、表层细胞支架的塑形和复合支架组装

以锡箔纸覆盖打印完成的阴茎形态内核支架，用硅胶对内核支架的左右两侧分别印模（以正中矢状面为界），得到的硅橡胶阴模灌铸石膏阳模。参考文献[16]的方法，将已塑形的左右两部分PGA/PLA细胞支架嵌套在三维打印的阴茎内核支架左右两侧，在两侧细胞支架对合的缝隙处，滴加PLA溶液并施以适当压力，拟合缝隙。

1.6 软骨复合物的体外构建

取第1代乳猪关节软骨细胞，以1×108cells/mL的浓度，接种于PGA/PLA-PLA/HA复合支架，5 h后，细胞与材料充分黏附，加入培养液体外培养，每2天换一次液。4周后，将构建物植入裸鼠背部皮下，在裸鼠体内培养8周。

1.7 大体及组织学观察

8周后取材，观察构建物颜色、质地，大体判断是否为成熟软骨，表层软骨是否连续，形状维持情况；将构建物沿正中矢状面剖开，观察软骨厚度、是否均一，外部软骨和内部多孔PLC/HA的界面整合情况。以4%多聚甲醛固定标本，30%蔗糖脱水，OCT包埋，冰冻切片（10 μm厚），HE染色，观察组织结构及细胞外基质分泌情况。

2 结果

2.1 细胞形态观察及PGA/PLA生物相容性评估

光镜观察发现，软骨细胞形态呈长梭形、多角形，增殖快。圆柱形细胞支架直径9 mm，厚1.5 mm。电镜显示，支架呈多孔结构，PLA增强了PGA之间的交联，PGA/PLA显示出很好的生物相容性，细胞黏附在PGA上，并且分泌基质覆盖纤维（图1）。

图1 细胞形态观察及材料生物相容性评估Fig.1Morphological observation of chondrocytes and evaluation of biocompatibility of PGA/PLA scaffold

2.2 茎模型的打印

PCL/HA混料均匀，三维打印的阴茎模型长3 cm，形态逼真，冠状沟明显，符合正常比例结构，材料内部为规则交叉的微小通道结构（图2）。

图2 计算机辅助设计及3D打印制作阴茎内核支架Fig.2Preparation of PCL/HA scaffold by CAD/CAM technique

2.3 PGA/PLA支架的制备及复合支架的组装

阴模与阳模对合紧密，阳模石膏质地坚硬而阴模树脂弹性好，两者组合，利于对PGA材料加压塑形。塑形完成的PGA细胞支架形态逼真，冠状沟处尤其突出，质地如蛋壳，厚度1.5 mm。复合支架由外部的PGA/PLA细胞支架和内部的PCL/HA核构成。内、外两部分匹配度高，嵌合紧密。完成的复合支架形态逼真。经过拟合，左右两部分细胞支架结合为一体，仅留下一条浅淡的痕迹（图3）。

图3 复合支架的制备过程Fig.3Preparation of PCL/HA-PGA/PLA composite scaffold

2.4 组织工程构建软骨的大体及组织学观察

复合物在构建过程中，形态维持良好，体外培养4周后，表面形成一层不成熟的软骨样组织。植入裸鼠皮下后，无感染等发生，切口愈合好，皮肤无破损（图4）。

图4 软骨体内构建Fig.4Reconstruction of cartilage in vivo

裸鼠体内培养8周后取材，大体为质硬、瓷白色软骨样组织，构建物表面光滑、连续，未见血管化。构建物的形状和大小维持良好。纵切面观察，发现PCL/HA核完全被软骨包裹，相互交错，紧密结合。HE染色显示，阴茎假体外围软骨层与内核支架融合，有部分软骨细胞及纤维结缔组织长入支架内部，外围软骨细胞结构成熟并有软骨陷窝形成，提示构建的阴茎软骨复合体所形成的周围软骨组织完整，随着时间的延长，可与内部支架紧密结合成为整体（图5）。

图5 体内8周组织大体观及组织学情况Fig.5Gross view and histological observation of tissue harvested after implantation for 8 weeks

3 讨论

组织工程软骨是目前阴茎支撑体的主要研究方向，针对“中空”现象、力学强度不足、精确形态控制这三个再生阴茎软骨支撑体的主要难题，本研究试图通过三维打印和数字翻模技术制备复合支架，并应用组织工程技术再生软骨，构建阴茎支撑体。

目前用于软骨构建的主要材料有PGA、胶原、凝胶支架和Pluronics等。其中，凝胶支架、Pluronics、胶原的力学强度低，难以维持特定形态[17]；PGA组织相容性好、降解速率适中、细胞黏附性好、易塑形，在特殊形态软骨构建中具有明显优势，PLA包埋PGA作为细胞支架现已应用于各种形态组织工程软骨的构建[9-11]。但是，大体积软骨的构建始终面临着“中空”的问题[18]，这是由于构建物中心远离表面，营养难以渗入，内部的酸性代谢产物也难以排出而蓄积，导致中心部分细胞活性变差乃至死亡，最终形成空洞，致使软骨构建失败。由于软骨构建存在的厚度限制，单纯以PGA/PLA为材料难以构建大体积软骨。本研究在PCL/HA内核外层仅包被厚度为1.5 mm的PGA/PLA细胞支架，再生约1.5 mm厚度的软骨，避免超过再生软骨的厚度限制，从而避免了“中空”的问题。体内8周组织学结果显示，PCL/HA内核外层再生出连续、均质、成熟的软骨组织。

再造阴茎是否有足够的强度以满足性生活的需要，是衡量再造阴茎的一个重要指标，单纯以PGA/ PLA为细胞支架构建的软骨力学强度不足，难以满足阴茎软骨支撑体对强度的需求。本研究利用PCL良好的可塑性和较强的力学性能，通过三维打印技术，制备出具备精确人阴茎形态的PCL/HA内核，作为组织工程软骨的内部支撑，其力学强度足以满足阴茎支撑体的需求。阴茎支撑体的表层软骨将PCL/ HA内核完全包裹，内核支架与机体之间形成有效隔离，避免了PCL/HA内核引起的免疫反应，同时有效减缓了PCL的降解速率，PCL/HA的长期留存可以保证阴茎支撑体强度的长期维持。

本研究通过对正常人阴茎进行激光轮廓扫描/磁共振断层扫描，结合图像三维重建技术，建立精确的人阴茎形态数字模型，并基于三维打印技术，制备出具有精确的人阴茎形态PCL/HA内核。应用数字翻模技术，在PCL/HA内核外层包被PGA/PLA细胞支架，组装完成的复合支架仍可保持精确的人阴茎形态，解决了应用组织工程技术构建阴茎软骨支撑体的形态控制问题。本研究结果显示，三维复合支架、体外构建4周及裸鼠体内8周的软骨支撑体，均具有阴茎头、冠状沟、阴茎体等阴茎正常解剖结构，实现了阴茎软骨支撑体的形态控制。三维打印的内核表面具有规则的孔道结构，有利于外层软骨组织与内核支架形成良好的嵌合，从而使阴茎支撑体成为完整的整体。本研究结果显示，薄层的组织工程软骨与内核嵌合紧密，融合成统一的整体，降低了外层软骨组织与内核之间发生移位的可能性。

综上所述，基于3D打印和数字翻模技术可成功制备出具备精确人阴茎形态的三维复合支架，结合组织工程技术可构建出内核为PCL/HA支架、外层包被成熟软骨的人阴茎形态软骨支撑体。

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Construction of Penis-Shaped Cartilage Using Tissue Engineering and 3D Printing Technologies

YUAN Zhaoyuan1, NING Jin1,CHEN Jie2,XIA Huitang2,TAO Ran2,ZHOU Guangdong1,2,3,XIAO Kaiyan2,CAO Yilin2,3．
1 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College,Weifang 261042,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery; Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China．Corresponding author:CAO Yilin(E-mail:yinlincao@yanhoo.com);XIAO Kaiyan(E-mail:xky7026@163.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of constructing a penis-shaped cartilage using tissue engineering and 3D printing technologies.MethodsA composite scaffold composed of PCL/HA and PGA/PLA were prepared for the reconstruction of penis-shaped cartilage by 3D printing.The penis-shaped PCL/HA scaffold prepared by 3D printing was beset between two separate PGA/PLA scaffolds that have a penis-shaped appearance.Articular chondrocytes were obtained from one-day-old roasters and then proliferated in order to meet the need of seeding sufficient cell into grafts.Cell-seeded constructs were cultivated in cartilage-inducing media for 4 weeks and then implanted under the dorsum skin of athymic nude mice.After 8 weeks'cultivation in vivo,constructs were harvested and grossly observed.Then the specimens were sagittally dissected to observe the interface between the regenerated cartilage and the porous PCL/HA scaffold and histology of engineered cartilage was examined in vivo.ResultsPenis-shaped models made of PCL/HA were printed into an exact penis shape and then composite scaffolds were assembled into a verisimilar penis.In the process of reconstruction,the initial shape of cell-seeded constructs were generally maintained.The surface of the specimens was smooth and continuous and no vascularization was observed.In cross section,the PCL/HA core were completely surrounded by the homogeneous neocartilage and the two phase interlocked well with each other.ConclusionIt is feasible to construct a penis-shaped cartilage with the PCL/HA core surrounded by the homogeneous neocartilage by using tissue engineering and 3D printing technologies.

Tissue engineering;3D-printing;Composite scaffold;Penis cartilage

Q813.1+3

A

1673－0364（2017）03－0123－05

2017年3月19日；

2017年4月29日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.03.002

上海市卫生局项目（课题编号：20134323）。

261042山东省潍坊市潍坊医学院整形外科研究所（袁兆远，宁进，周广东）；200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科，上海市组织工程研究重点实验室（陈洁，夏会堂，陶然，周广东，肖开颜，曹谊林）；200241上海市组织工程国家工程研究中心（周广东，曹谊林）。

曹谊林（E-mail：yinlincao@yanhoo.com）；肖开颜（E-mail：xky7026@163.com）。