秋水仙碱处理对鸦胆子幼苗生长的影响

2017-07-13邓宇豪曾国亮李林锋

安徽农业科学 2017年2期

邓宇豪曾国亮李林锋

摘要[目的]探讨秋水仙碱处理诱导鸦胆子多倍体的可能性。[方法]以二倍体鸦胆子[Brucea javanica （L.）Merr.]为材料，用0.1%、 0.3% 、0.5%和1.0%的秋水仙碱对幼苗茎尖生长点进行点滴处理，研究其对鸦胆子生长的影响。[结果]0.1%、0.3%、0.5%、1.0%秋水仙碱处理不同程度地抑制了鸦胆子幼苗植株的生长速度，与对照植株相比，分别平均降低8.3%、36.4%、37.0%和55.4%。各处理鸦胆子幼苗叶片气孔保卫细胞纵径、横径、周长、等视野气孔数及叶绿粒数间存在显著差异；随处理浓度的增加，叶片气孔保卫细胞数减少，气孔变大，叶绿粒数增多。秋水仙碱顶芽生长点诱变处理后形成的瘤块严重影响诱变新梢次年生长。[结论]鸦胆子幼苗生长点秋水仙碱诱变处理获得多倍体植株的途径不可行。

关键词鸦胆子；秋水仙碱；幼苗生长；多倍体诱导

中图分类号 S723 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）02-0156-02

Abstract[Objective] To discuss the feasibility of inducing Brucea javanica polyploidy by colchicine.[Method] With diploid B. javanica seedlings as the experimental materials， 0.1%， 0.3%， 0.5% and 1.0% colchicine were used on the stem apex growing point to study the effect of colchicines on its growth.[Result] The results showed that colchicine treatment inhibits the growth of B. javanica seedlings at different levels. As compared with control， the plant height decreased averagely 8.3%， 36.4%， 37.0% and 55.4%， respectively. There was a significant difference among stomatal number at visual field， chloroplast number， the length， width and perimeter of guard cell of B. javanica seedlings. Stomatal number decreased， individual guard cell enlarged and chloroplast number increased with increasing concentration of colchicines. However， the mass located at the growing tip of bud after treatment affects the shoot growth of B. javanica seedlings seriously during the next year.[Conclusion] The way is not workable through the inducement of colchicine on growing tip of bud of B. javanica seedlings.

Key words Brucea javanica；Colchicines；Seedling growth；Polyploidy induction

鴉胆子[Brucea javanica （L.）Merr.]是苦木科鸦胆子属常绿灌木或小乔木，又名苦参子、老鸦胆、苦棒子等，始载于《本草纲目拾遗》，主要分布于海南、广东、广西和云南等地。鸦胆子性寒，味苦，具有清热解毒、截疟、止痢、腐蚀赘疣的功效，为我国传统中药[1-2]。自1973年Kupchan等[3]从苦木科植物抗痢鸦胆子的茎皮醇提取物中分离得到对人体鼻咽癌（KB）、P-388白血病及L1210淋巴白血病有较强抑制作用的活性成分鸦胆丁（Bruceantin）和鸦胆醇（Bruceantinol）后，引起了人们对苦木科植物抗肿瘤活性成分研究的极大关注，鸦胆子也不例外。到目前为止，从鸦胆子种子（果实）、根、茎（茎皮）、枝叶及花中已发现了153种化学成分[4]，主要有苦木内酯、生物碱、三萜和脂肪酸等。其中四环三萜苦木内酯类化合物是鸦胆子植物的特征性成分，具有杀虫止痢、抗疟、抗肿瘤、抗白血病、抗病毒、抗食素、抗炎以及降低血糖等多种生物活性[5]。虽然鸦胆丁具有较强的抗L1210淋巴白血病、抗Lewis肺癌及B16黑色素瘤的作用，但其在抗痢鸦胆子茎皮中含量为0.02 %[6]，分离和提纯都比较困难。如何开发更高产优质、更适合工业化生产的药用植物种质资源以满足人们对医疗保健方面的需求就显得越发必要和迫切。但鉴于药用植物的特殊性，无论何种用途，对其成分稳定性的要求均比粮食和香料等植物高[7]，这无疑给药用植物的育种工作提出了更高的要求。

多倍体植物染色体数量增多，有多套基因，新陈代谢旺盛，酶活性增强，从而提高了蛋白质、碳水化合物、维生素、植物碱、单宁等的合成速率[8]。生产实践发现，大多数药用植物多倍体化后其药用有效活性含量增加。如四倍体白芷药材中欧前胡素含量较二倍体增加了104.4%[9]；四倍体药用薯蓣中的薯蓣皂苷元含量比二倍体对照提高了20.0%[10]；多倍体杜仲幼苗中绿原酸含量较正常植株幼苗提高了17.78%[11]。虽然传统上鸦胆子以种子入药，其脂溶性成分鸦胆子油制剂已广泛应用于临床肿瘤的辅助治疗，但其同样具有较强抗肿瘤活性的水溶性苦木内酯类成分如鸦胆丁、鸦胆苦醇（brusatol）和鸦胆子苦素D（bruceine D）也有望应用于临床，成为新的化疗药物[12]。鉴于此，笔者以鸦胆子实生幼苗为材料，研究秋水仙碱茎端生长点点滴处理对其生长的影响，为鸦胆子多倍体育种方案奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鸦胆子种子采集于广东海洋大学后山交椅岭周边野生多年生鸦胆子母树，种子除去果肉，洗净阴干后用层积催芽法催芽。种子发芽（露白）后将其移栽到营养钵中，土壤为学校园林试验基地田园土。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计。

营养钵中的鸦胆子出土后待其子叶展开顶端分生组织刚刚开始萌动时，将脱脂棉球放在试材的生长点上，用针管将秋水仙素溶液滴在脱脂棉上，每次20 μL（药液呈水珠状而不滴落）[13]，秋水仙素浓度设0.1%、 0.3% 、0.5% 和1.0% 4个水平，每天07：00—08：00、18：00—19：00各处理1次，连续处理3 d，每处理20株幼苗，重复3次，以点滴蒸馏水为对照。达到处理时间后用清水将药液冲洗干净。所有处理植物均放在室外露天培养，自然光照，保证水肥充足。

1.2.2 测定内容。

1.2.2.1

形态指标观察。试验幼苗生长60 d后，测定幼苗株高，以植株生长缓慢、叶片变宽或增厚、叶片皱缩、畸形或质地粗糙等为形态变异标准，统计形态变异率。

1.2.2.2

气孔保卫细胞大小测定。10：00左右，取各处理植株叶片，用镊子撕下下表皮置于载玻片上，用碘-碘化钾溶液染色，制成片后在显微镜下观测。各处理叶片随机选取10个气孔器，分别测定气孔保卫细胞的纵径和横径、保卫细胞中的叶绿粒数，并随机取10个视野（10×40倍镜下）测量气孔器密度。由于在显微镜下观察到鸦胆子幼苗叶片下表皮气孔保卫细胞为肾形，两边对称，气孔外缘清晰，呈椭圆形，故鸦胆子叶片气孔保卫细胞外围周长值则利用椭圆周长的近似计算公式L=1.57×[1.5×（A+B）-（A-B）1/2] 来计算[14]，式中，A、B分别代表整个气孔保卫细胞的纵、横径。

1.3 数据处理

所有数据为平均值±标准误，采用SPSS 19.0软件对所有观测数据进行方差和多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度秋水仙碱处理对鸦胆子植株的影响

由表1可知，不同浓度秋水仙碱生长点处理后，对鸦胆子幼苗叶长、叶宽、叶长/叶宽、叶厚、株高的影响差异显著。秋水仙碱处理几乎不同程度地抑制了鸦胆子幼苗植株的生长速度，与对照植株相比，1.0%处理幼苗株高生长受抑制最严重，仅为对照植株高度的55.4%，其次为0.5% 和 0.3%处理，植株高度分别降低37.0%和 36.4%，0.1%处理影响较小。大部分生长点处理幼苗植株新长出的叶子形态发生了明显变化，叶片出现皱缩、粘合或畸形。经统计，发生叶形变化的植株在0.1%、0.3%、0.5%和1.0%处理水平的变异率分别为36.2%、50.0%、76.7%和86.7%；对照处理并无变异植株。由于叶片皱缩或畸形，故叶长和叶宽均有影响，随处理浓度的增加，叶宽比逐渐减小；且诱变叶叶片厚度较对照显著加厚。

2.2 不同浓度秋水仙碱处理对鸦胆子幼苗叶片气孔的影响

从图1可看出，秋水仙碱处理对鸭胆子幼苗叶片气孔器的密度、大小等特征均产生影响。各处理鸦胆子幼苗叶片的气孔保卫细胞在纵径、横径、周长、等视野气孔数上均具有显著差异（P<0.05）。与对照相比，随着秋水仙碱浓度的增加，鸦胆子幼苗叶片气孔保卫细胞显著增大，1.0%处理增幅最大，其叶片气孔保卫细胞纵径、横径和周长分别比对照增加26.4%、19.5%和56.4%；与此相反，等视野气孔数随处理浓度的增加显著减小。与对照相比，1.0%处理等视野气孔数减小最大，其叶片气孔数仅为对照的45.2%。同样，随着秋水仙碱浓度的增加，鸦胆子幼苗叶片气孔保卫细胞叶绿粒数显著增多，但0.1%、0.3%处理与对照之间差异不显著；1.0%处理叶绿粒数较对照增加近1倍，其次为0.5%处理，较对照增加33.8%，低浓度处理叶片气孔叶绿粒数与对照差异不显著（表2）。

3 讨论与结论

不同浓度的秋水仙碱处理对鸦胆子的生长造成很大影响，不仅幼苗株高生长受抑制而变矮，叶片皱缩变宽或增厚，且随秋水仙碱处理浓度的增加，叶片气孔变大，气孔数减少。有研究认为，多倍体较直观粗放的鉴定方法主要以受处理材料幼苗的子叶和真叶是否发生畸形、皱缩、增厚、叶色加深，中胚轴是否肿大变粗，植株生长是否受到抑制等标准来判断[15]，而气孔大小、密度，保卫细胞的长度、宽度和叶绿粒的数目可作为多倍体鉴定的间接指标[16]，植物叶片气孔大小、气孔保卫细胞叶绿粒数与植株的染色体倍性存在明显的相关性，叶片气孔保卫细胞的叶绿粒数随染色体倍性的增高而增加，不同染色体倍性间气孔保卫细胞的叶绿体数差异显著[17]。该试验0.5% 和1.0%浓度的秋水仙碱处理条件下，鸦胆子幼苗的叶片形态变异率较高，气孔保卫细胞周长较大，叶绿粒数较多，但由于未进行细胞学鉴定，各诱变植株的染色体是否加倍，需要进一步研究。但秋水仙碱对鸦胆子幼苗的毒害作用比较大，尤其是随着处理浓度的增大，抑制生长的效果越大。药剂处理后，茎端生长点愈伤组织隆起、膨大形成瘤块，着生其上的诱变新芽和枝条早期生長比较缓慢，在处理当年秋季落叶后，次年春季则逐渐干枯死亡，严重影响对诱变植株的进一步筛选和培育。由此可见，鸦胆子通过秋水仙碱幼苗顶芽诱变处理获得多倍体的途径不可行。

参考文献

[1] 杨峰，于江，王凤礼，等.鸦胆子的研究概况[J].黑龙江医药，1998，11（2）：112-113.

[2] 丁晨旭，索有瑞.中药鸦胆子化学成分及药理学研究进展[J].中成药，2006，28（1）：117-120.

[3] KUPCHAN S M，BEAR A，KUOHSING，et al.Bruceantin，a new polent antieukemic simaroubolide from Brucea antidysenterica.[J].Journal of organic chemistry，1973，38（3）：178.

[4] ZHAO L J，LI C，ZHANG Y，et al.Phytochemical and biological activities of an anticancer plant medicine：Brucea javanica[J].Anticancer agents in medicinal chemistry，2014，14（3）：440-458.

[5] 周中流，梁燕君，黄诗瑶，等.鸦胆子属植物苦木内酯类化合物的研究进展[J].中成药，2013，35（5）：1040-1046.

[6] 李铣.鸦胆丁及有关苦木内脂的抗肿瘤活性[J].沈阳药学院学报，1978（10）：28-37.

[7] 何韩军，杨跃生，吴鸿.药用植物多倍体的诱导及生物学意义[J].中草药，2010，46（6）：1000-1006.

[8] 李铁军，王丽珍，杜雪.药用植物多倍体的研究概况[J].中药材，2009，32（9）：1481-1485.

[9] 彭菲，张胜，刘塔斯，等.四倍体白芷药材中欧前胡素的含量测定[J].中国中药杂志，2002，27（6）：426-427.

[10] 刘选明，李光明，秦玉芝，等.药用薯蓣高皂素新种质选育的研究[J].湖南大学学报（自然科学版），2004，31（3）：19-22.

[11] 王跃华.杜仲种子的多倍体诱导研究[J].亚太传统医药，2006（8）：73-76.

[12] 赵丽娟.鸦胆子化学成分及生物活性研究[D].济南：山东大学，2014：19-21.

[13] 童俊.秋水仙素诱导紫薇多倍体的研究[D].武汉：华中农业大学，2007：10-12.

[14] 张菊平，周快索，巩振辉，等.用气孔保卫细胞周长鉴定辣椒植株的倍性[J].西北农业学报，2007，16（2）：133-135，141.

[15] 王真，陈道明，李春燕，等.半支莲多倍体诱导的初步研究及鉴定[J].广东农业科学，2010（8）：74 -77.

[16] 王艷英，邓传远，赵晓明，等.秋水仙素处理对连翘生长的影响[J].蚌埠学院学报，2014，3（1）：20-23.