生物法生产25—羟基维生素D3条件优化

付跃 李连威 张阳阳

摘要[目的]优化25-羟基维生素D3[25（OH）VD3]的转化条件，提高25（OH）VD3产量。[方法]通过单因素试验和正交试验对菌株UV-FY-141转化生产25（OH）VD3的条件进行优化。[结果]确定其最佳发酵培养基：葡萄糖15.00 g，蛋白胨20.00 g，NaCl 5.00 g，CaCO3 2.00 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，去离子水1 000 mL。优化后转化条件：发酵初始pH 6.5，发酵温度为28 ℃，发酵时摇床转速为200 r/min，发酵时间为72 h。在优化条件下，25（OH）VD3产量由原来的9.460 mg/L提高到13.130 mg/L，提高了38.79%。[结论]采用优化后的转化条件，可显著提高25（OH）VD3的产量。

关键词 25-羟基维生素D3；优化；发酵

中图分类号 R914.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）02-0007-04

Abstract[Objective] The aim was to optimize the conversion efficiency of 25（OH）VD3.[Method]We optimized fermentation conditions of strain UVFY141 by single factor and orthogonal experiment.[Result] The optimum fermentation conditions were determined as follows：glucose 15.00 g，peptone 20.00 g，NaCl 5.00 g，CaCO3 2.00 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，and deionized water 1 000 mL.Conversion conditions were determined as follows：initial pH 6.5，fermentation temperature 28 ℃，rotation speed 200 r/min，fermentation time 72 h.The production of 25（OH）VD3 was improved by 38.79%，from 9.460 mg/L to 13.130 mg/L.[Conclusion] The optimized conditions can improve the yield of 25（OH）VD3 significantly.

Key words 25（OH）VD3；Opitimization；Fermentation

维生素D3（VD3）在人体内是没有活性的，只有转化成有活性的代谢产物才能发挥作用。维生素D3的活性衍生物主要有骨化二醇、骨化三醇等。维生素D3首先在肝脏转化成骨化二醇，然后在肾脏中转化成骨化三醇[1]，其中骨化二醇是血液中主要存在形式，骨化三醇是最有活性的代谢衍生物[2]。25-羟基维生素D3[25（OH）VD3]，又称骨化二醇，是通过人体内的VD3羟化酶转化而来的[3-4]，对光、空气、热敏感，不溶于水，易溶于乙醇等极性有机溶剂[5]。骨化二醇临床上用于治疗甲状腺功能衰退、骨质疏松、牛皮癣、慢性肾功能衰竭[1]。骨化二醇能够化学合成，但是步骤复杂，成本高，相对于化学合成，生物转化具有明显优势。研究表明，一些微生物能够将维生素D3转化成骨化二醇和骨化三醇，步骤简单，成本低[6]。生物转化速率不仅受微生物培养组分、培养过程的影响，而且受培养条件（pH、温度等）的影响[7] 。发酵条件的优化对生物转化生产VD3十分重要。笔者采用单因素试验和正交试验对生物法合成25（OH）VD3条件进行了优化，旨在为提高VD3的转化率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌种。

放线菌UV-FY-141：广西大学生命科学与技术学院食品与发酵研究所保存。

1.1.2 试验药剂。维生素D3（分析纯）、25-羟基维生素D3（分析纯），美国Sigma公司；氯化钠（分析纯），天津博迪化工有限公司。

1.1.3 培养基。

斜面培养基：可溶性淀粉20.00 g，硝酸钾1.00 g，NaCl 0.50 g，磷酸氢二钾0.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，去离子水1 000 mL。种子培养基：葡萄糖15.00 g，蛋白胨15.00 g，玉米浆干粉5.00 g，NaCl 5.00 g，CaCO3 2.00 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0。发酵培养基：葡萄糖15.00 g，植物用大豆蛋白胨15.00 g，玉米浆干粉5.00 g，NaCl 5.00 g，CaCO3 2.00 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.4 仪器。

EBA21型高速离心机，Hettich zentrifugen公司；YP1200型电子天平，上海精科实业有限公司；岛津10-AT高效液相色谱仪，日本岛津有限公司；UV1601紫外分光光度计，日本Shimadiu公司；依利特Hypersil C18 色谱柱（4.60 mm×250.00 mm，5 μm），美国热电公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化。

从-80 ℃冰箱中取出甘油保藏的菌种UV-FY-141，接种到装液量为50.00 mL的250.00 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min培养7～15 d；细菌活化好后梯度稀释，涂平板，在28 ℃生化培养箱中培养7 d；用接种环挑取单菌落，接种到斜面培养基；在28 ℃生化培养箱中培养7 d，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 孢子溶液的制备。

从-20 ℃冰箱中取出斜面，灭菌15～20 min，用5.00 mL移液枪向斜面加灭菌去离子水10.00 mL，用接种环轻轻刮下孢子，用移液枪反复吹打后转移到装有玻璃珠的50.00 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min振荡30 min，打散孢子，然后4层纱布过滤，制备孢子悬液。

1.2.3 发酵。用移液枪吸取1.00 mL孢子悬液接种到种子培养基中，28 ℃、180 r/min培养48 h，吸取1.00 mL种子液接种到发酵培养基中，48 h后向发酵培养基中加入用无菌滤膜过滤的反应底物，相同条件下继续培养72 h。

1.2.4 发酵条件优化。

为了提高25（OH）VD3的产量，对发酵条件进行优化，主要优化碳源、氮源、无机盐离子、初始pH、温度和转速。控制其他条件不变，只改变其中1个条件逐步优化。优化完成后，选择对发酵影响显著的单因素进行正交试验，选择最优条件。

1.2.5 供试品的制备。

采用Bligh-Dyer法[8]制备供试品。发酵结束后取1.00 mL发酵液于离心管中，每个样品中加入3.75 mL氯仿和甲醇的混合溶液（1∶2，V/V），振荡混匀后再向其中加入1.25 mL氯仿溶液，振蕩混匀，此时会看到大量絮状沉淀，然后加入1.25 mL纯水，振荡混匀，此时会看到溶液分层；6 000 r/min离心5 min。取1.00 mL下层溶液于离心管中，旋转蒸发仪干燥。检测时用乙腈溶解，并用无菌滤膜过滤。

1.2.6 标准溶液的制备。

称25（OH）VD3标准品1 mg，溶解于10.00 mL无水乙醇中，配制成100 μg/mL母液。稀释母液为20、40、60、80、100 μg/mL梯度浓度标准液。

1.2.7 检测条件。

采用依利特Hypersil C18色谱柱（4.60 mm×250.00 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（80∶20，V/V），流速为1 mL/min，柱温设为50 ℃，检测波长为265 nm。

2 结果与分析

2.1 碳源对25（OH）VD3产量的影响

碳源是一类能够提供碳素化合物的营养物质，能够为微生物新陈代谢提供生命活动所需的能量，提供细胞或合成产物的物质基础。选择可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖5种碳源按2%的添加量加入到培养基中进行单因素试验。由图1可知，以葡萄糖为碳源时，25（OH）VD3的产量最高，所以选择葡萄糖作为发酵过程中的碳源。

选择合适的碳源浓度进行试验。由图2可知，在一定浓度范围内25（OH）VD3 的产量随着葡萄糖浓度升高而升高，超过一定浓度后产量下降，当葡萄糖浓度为2%时25（OH）VD3产量最高，所以发酵浓度选择2%。

2.2 氮源对25（OH）VD3产量的影响

氮源也是微生物生长和合成产物的重要物质。选择酵母膏、蛋白胨、玉米浆干粉、KNO3、NH4Cl进行试验，添加量为2%。由图3可知，蛋白胨对发酵影响显著。因此，对蛋白胨的浓度进行优化。由图4可知，25（OH）VD3产量随蛋白胨浓度的增加先升高后降低，在蛋白胨浓度为3%时达到最大值。因此，发酵培养基中蛋白胨浓度选择3%。

2.3 无机盐离子对25（OH）VD3产量的影响

无机盐离子对微生物生长和产物合成也十分重要。它们或者是酶活性中心组成成分，或者参与维持大分子和细胞结构的稳定性，调节渗透压平衡，控制细胞的氧化还原电位，或者作为微生物生长的能源物质。微生物生产代谢所需要的无机盐一般包括磷酸盐、硫酸盐、氯化物及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。研究CaCO3、MeSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4、CaCl2对25（OH）VD3产量的影响。由图5可知，NaCl、CaCO3对发酵影响显著。因此，对该2种无机盐离子的浓度进行研究。由图6可知，25（OH）VD3的产量随着CaCO3浓度的升高先升高后降低，当CaCO3浓度为0.2%时25（OH）VD3产量最高；当NaCl浓度为0.5%时25（OH）VD3产量最高。因此，2种无机盐离子及其浓度分别选择0.5%NaCl和0.2%CaCO3。

2.4 发酵培养基组分的正交试验结果

通过单因素试验发现，葡萄糖、蛋白胨和CaCO3的浓度对25（OH）VD3产量影响显著，因此，选择这3个单因素进行L9（34）正交试验，每组试验设3个平行（表1）。

由表2可知，在试验2的条件下，25（OH）VD3的产量最高，为11.130 mg/L，此时发酵培养基中营养成分的配比为葡萄糖1.50%、蛋白胨3.00%、CaCO3 0.20%。在上述条件下重复试验，试验结果与试验2结果基本一致，所以培养基的最佳配比为A1B2C2。极差值RA>RB>RC，所以3个因素对25（OH）VD3产量影响大小排序为葡萄糖、蛋白胨、CaCO3。

方差分析表明，FA>FB> F0.95（2，2）>FC，表明葡萄糖和蛋白胨对25（OH）VD3产量影响显著，CaCO3影响不显著。

2.5 初始pH对25（OH）VD3产量的影响

微生物生长需要适宜的环境，其中pH是一项重要的因素。pH能够改变蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷，可引起细胞膜的电荷变化，改变微生物细胞吸收和利用营养物质的能力。不同微生物对pH的要求各不相同，因此，选择合适的pH对微生物发酵具有重要意义。研究初始pH 5、6、7、8、9对25（OH）VD3产量的影响，由图7可知，25（OH）VD3的产量随着初始pH的升高而先升高后降低，当pH为7时25（OH）VD3产量最高， 所以发酵时选择pH 7。

2.6 温度对25（OH）VD3产量的影响

溫度是微生物生长的重要因素之一，不仅可以影响酶活性，改变酶的反应速率，还能够影响细胞膜的流动性，改变物质的运输能力，从而影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。研究发酵温度26、28、30、32、34 ℃对25（OH）VD3产量的影响，由图8可知，在一定温度范围内，25（OH）VD3的产量随温度的升高而升高，超过一定范围，随温度的升高而降低。温度对产物产量的影响主要通过影响酶的活性来实现，同时温度的高低还会影响细胞膜的通透性，当温度适合时细胞膜的通透性增强，可以使更多的反应底物通过细胞膜，当温度为28 ℃时25（OH）VD3的产量最高，确定发酵温度为28 ℃。

2.7 摇床转速对25（OH）VD3产量的影响

摇床转速与三角瓶中的溶氧量有直接关系，主要通过溶氧量来影响发酵，转速较慢时，发酵液中的溶氧量少，不利于细菌发酵，如果过快则对细菌损伤大，也不利于发酵。研究转速140、160、180、200、220 r/min对25（OH）VD3产量的影响，由图9可知，当摇床转速为200 r/min时，25（OH）VD3的产量最高。分析原因，当摇床转速为200 r/min时，摇瓶中的容氧量充足，机械碰撞对菌体的损伤相对较小，两者达到平衡，有利于产物的合成。因此，选择200 r/min为发酵时的摇床转速。

2.8 发酵时间对25（OH）VD3产量的影响

发酵时间对产物合成的影响也十分显著，因为随着发酵时间的延长，菌体的状态、培养基组分、pH等都会发生变化，因此，对发酵时间进行优化十分必要。加入底物后，每隔12 h测1次产量，记录12、24、36、48、60、72、84、96 h的产量。由图10可知，加入反应底物后，25（OH）VD3的产量开始升高，60 h后产量基本稳定，所以确定发酵时间为60 h，与原来发酵时间相比，发酵时间缩短了12 h。

2.9 转化条件正交试验结果

经过单因素试验发现，初始pH、发酵温度和摇床转速3个因素对25（OH）VD3的产量影响显著，因此，选择这3个单因素进行L9（34）正交试验，每组试验设3个平行（表3）。

由表4可知，在试验2的条件下，25（OH）VD3的产量最高，为13.130 mg/L左右，此时转化条件的3个因素为：pH 6.5，发酵温度为28 ℃，转速为200 r/min。在上述条件下重复试验，试验结果与试验2结果基本一致，所以培养基的最佳配比为A1B2C2。极差值RA>RB>RC，所以3个因素对25（OH）VD3产量影响大小排序为pH、发酵温度、摇床转速。

方差分析表明，FA >F0.95（2，2）>FB>FC。因此，pH对25（OH）VD3产量影响显著，温度和转速影响不显著。

3 结论

通过单因素试验和正交试验对发酵培养基和转化条件进行优化，确定发酵培养基的组成：葡萄糖15.00 g，蛋白胨20.00 g，NaCl 5.00 g，CaCO3 2.00 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，去离子水1 000 mL。优化后转化条件：发酵初始pH为6.5，发酵温度为28 ℃，摇床转速为200 r/min，发酵时间为72 h。优化后，25（OH）VD3产量由原来的9.46 mg/L提高到13.13 mg/L，提高了38.79%。

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