甲基叔丁基醚对斑马鱼及中国仓鼠卵巢细胞的毒性效应

洪文旭 熊法德 曾序春

摘要[目的]研究甲基叔丁基醚（MTBE）对斑马鱼和中国仓鼠卵巢细胞的毒性作用及氧化应激效应，为其科学、合理应用提供依据。[方法]应用半静态试验法研究不同浓度MTBE对斑马鱼的急性毒性效应，以中国仓鼠卵巢（CHO）细胞为模型，分析不同浓度MTBE对CHO细胞增殖水平和氧化应激相关酶活力水平的影响。[结果]MTBE对斑马鱼的48 h LC50值为71.5 mg/L；在细胞试验中，当MTBE暴露浓度高于5.0 mmol/L时，CHO细胞增殖水平受到明显抑制（P<0.05）；当MTBE暴露浓度达到50.0 mmol/L时，SOD活力明显上升（P<0.05）。当MTBE浓度达到25.0 mmol/L时，CAT活力达到最大值且与对照组差异显著（P<0.05）；当MTBE浓度达到25.0 mmol/L时，CHO处理组GSH-Px活力明显上升（P<0.05）。[结论]MTBE暴露可以诱导斑马鱼和CHO细胞的毒性作用，而氧化应激酶活力水平的改变可能是MTBE毒性作用之一。

关键词 甲基叔丁基醚；斑马鱼；中国仓鼠卵巢细胞；毒性作用；氧化应激

中图分类号 R99 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）02-0004-03

Abstract[Objective] To study the toxicological effects and oxidative stress of methy tertbutyl ether （MTBE） on zebra fish and Chinese hamster ovary （CHO） cells and provide basis for its scientific and reasonable application.[Method] Acute toxic effects of MTBE on zebra fish were studied by static experiment method.By using CHO cells as test model，the effects of different concentrations of MTBE on proliferation level and the activities of enzymes related with oxidative stress of CHO cells were analyzed.[Result] LC50 of MTBE to zebra fish at 48 h was 71.5 mg/L.In cellular assay，when the exposure concentration of MTBE was higher than 5.0 mmol/L，the proliferation of CHO cells was inhibited （P<0.05）.When the exposure concentration of MTBE was 50.0 mmol/L，SOD activity obviously increased （P< 0.05）.When the exposure concentration of MTBE was 25.0 mmol/L，CAT activity reached the maximum value，and it had significant differences with CK （P<0.05）.When the exposure concentration of MTBE was 25.0 mmol/L，GSHPx activity in CHO treatment group obviously increased （P<0.05）.[Conclusion] MTBE exposure can induce the toxicity to zebra fish and CHO cells，and the activity changes of oxidative stressrelated enzymes may one mechanism of MTBEinduced toxicity.

Key words Methyl tertbutyl ether；Zebra fish；Chinese hamster ovary cells；Toxicological effect；Oxidative stress

甲基叔丁基醚（Methyl tertbutyl ether，MTBE）作為汽油添加剂，可以增加汽油的辛烷值，提高汽油燃烧效率，减少一氧化碳和其他有害物质（如臭氧、苯）的排放，降低空气污染[1]。随着MTBE的普遍推广使用，对其毒理学研究也在不断深入，研究表明MTBE对职业人群能产生一定的危害。随着国内各大城市机动车数量的快速增长，大量的汽车尾气导致MTBE排放到大气中，形成新的空气污染问题。在珠江三角洲地区，大气环境中已经能够普遍检测出MTBE污染物[2]。MTBE有较强的水溶性，容易渗入土壤污染水体，严重威胁人们的饮用水源。开展MTBE的毒性效应研究，对于建立全面的MTBE健康风险评估具有十分重要的意义[3]。

斑马鱼具有与人类相似的各种器官系统，且斑马鱼基因与人类基因的相似度高达87%。国际标准化组织于20世纪80年代推荐斑马鱼为毒性试验的标准试验用鱼， 目前斑马鱼已被作为健康毒性和环境毒性检测试验的标准鱼类，受到生物学家的重视并被作为鱼环境毒理学研究的模式生物[4]。中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞是一类具有强大生命力、本身很少分泌內源蛋白的细胞株，在生物工程、药学及毒理学等体外研究中被广泛使用[5]。目前，关于MTBE的毒性研究主要集中在雄性生殖细胞上[6]，在斑马鱼和中国仓鼠卵巢细胞上的相关报道很少。笔者研究了MTBE对斑马鱼的急性毒性及其对CHO细胞的氧化应激作用，旨在为MTBE的毒性评价提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。斑马鱼由深圳大学提供，平均体长（26.0±2.0） mm，平均体重（0.26±0.11）g；中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，购自中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心）。

1.1.2 仪器与试剂。HF safe-1200 A2型生物安全柜，为上海力新仪器有限公司产品；3111型CO2恒温培养箱，为美国Thermo Forma公司产品；GS-15R台式冷冻离心机，为美国Beckman公司产品；二甲基亚砜，购自美国Sigma公司； 甲基叔丁基醚，购自上海阿拉丁公司。RPMI-1640培养基粉、双抗（青霉素、链霉素）、胎牛血清（FBS），均购自美国GIBCO公司；总SOD活力检测试剂盒、过氧化酶检测试剂盒及细胞裂解液，均购自上海碧云天生物公司；德国Eppendorf移液枪；5 L玻璃水槽。

1.2 方法

1.2.1 MTBE对斑马鱼的急性毒性试验。采用半静态试验法，设定甲基叔丁基醚浓度梯度分别为10、20、40、60、80、100 mg/L。在水槽中装入4 L经曝气的自来水（去氯处理），pH为（7.5±0.5），水中溶氧量大于空气饱和值的80%，水质硬度为（205±13）mg/L（以CaCO3计），温度为（27.0±1.0）℃。采用自然光与白炽灯光照明，每天喂食2次。每槽饲养斑马鱼10尾，设置6个浓度梯度，每个浓度梯度设置3个平行，同时设置空白对照组和助溶剂对照组。试验期间不喂食，前8 h连续观察，记录鱼的反应情况，及时捞出死亡个体，此后48 h观察并记录鱼的死亡情况。判断鱼的死亡标准：鱼腹部向上，鳃盖停止运动，用玻璃棒轻击鱼尾部，若鱼体不产生任何反应，判定为死亡。根据各组试验鱼的48 h死亡率，计算平均死亡率，然后采用寇氏法计算MTBE对斑马鱼的48 h LC50，计算公式：

lgLC50=Xm-i（∑p-0.5）

式中，Xm为死亡组最大剂量的对数值；i为相邻2组剂量对数值之差；p为各组某一时间点的死亡率；∑p为某一时间点的死亡率之和[7]。

1.2.2 MTBE对CHO细胞的毒性试验。将CHO细胞置于添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的MEM培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞生长至融合度80%时，于含浓度分别为0、0.5、5.0、25.0、50.0、100.0 mmol/L MTBE溶液的MEM培养基中进行暴露，置于培养箱中培养12 h后，加入20 μL的MTT试剂，于37 ℃培养箱中培养4 h，在490 nm波长处使用酶标仪检测吸光度（A）值，参比波长为630 nm，计算细胞增殖存活率和半抑制浓度（IC50）。按照以下公式计算抑制率（IR）：

IR=[（空白對照组A值-处理组A值）/（空白对照组A值-本底组A值）]×100%

1.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活力的测定。将处于对数生长期的CHO细胞置于含终浓度分别为0（对照）、0.5、5.0、25.0、50.0、100.0 mmol/L MTBE的MEM培养基中暴露12 h，用细胞裂解液裂解细胞，离心取上清液，采用Bradford法测定蛋白浓度；在560 nm处测定吸光度值，使用总SOD活力检测试剂盒测定SOD活力，具体操作按照试剂盒说明书进行。将黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时反应体系中的SOD活力单位定义为1个酶活力单位（U），用蛋白浓度校正，活力单位为U/mg prot表示。

1.2.4 过氧化氢酶（CAT）活力的测定。将处于对数生长期的CHO细胞置于含终浓度分别为0（对照）、0.5、5.0、25.0、50.0、100.0 mmol/L MTBE的MEM培养基中暴露12 h，用细胞裂解液裂解细胞，离心取上清液，采用Bradford法测定蛋白浓度，在520 nm处测定吸光度（A）值，使用CAT活力检测试剂盒测定CAT活力，具体操作按照试剂盒说明书进行。CAT活力采用蛋白值校正，酶活力单位用U/mg prot表示。

1.2.5 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的测定。将处于对数生长期的CHO细胞置于含终浓度分别为0（对照）、0.5、5.0、25.0、50.0、100.0 mmol/L MTBE的MEM培养基中暴露12 h，使用细胞裂解液裂解细胞，离心取上清液，采用Bradford法测定蛋白浓度，使用GSH-Px活力检测试剂盒测定GSH-Px活力，具体操作按照试剂盒说明书进行。GSH-Px活力采用蛋白值校正，酶活力单位用U/mg prot表示。

1.2.6 数据统计与分析。试验数据使用GraphPad Prism 6软件进行统计与分析，结果均以平均值±标准差表示。2组均数间的比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 MTBE对斑马鱼的毒性作用 斑马鱼在100 mg/L的MTBE溶液中饲养3 h后开始出现毒性反应，在80 mg/L的MTBE溶液中饲养6 h后开始出现毒性反应，在60 mg/L的MTBE溶液中饲养12 h后开始出现毒性反应，斑马鱼初期表现为游动能力下降，随着时间的延长出现失去平衡，无运动能力的现象，最后躺卧死亡。斑马鱼在10～40 mg/L的MTBE、溶剂对照组和空白对照组的试验溶液中饲养48 h，未发现斑马鱼有任何毒性反应。根据各组斑马鱼的死亡情况，计算各组死亡率。当MTBE浓度为60 mg/L时，斑马鱼死亡数为2，死亡率20%；当MTBE浓度为80 mg/L时，死亡率为60%；当MTBE浓度为100 mg/L时，死亡率达到100%。采用寇氏法计算出MTBE对斑马鱼的48 h LC50为71.5 mg/L。

2.2 不同浓度MTBE对CHO细胞增殖水平的影响 从图1可以看出，经MTBE暴露处理12 h后，与对照组相比，当MTBE暴露浓度高于5.0 mmol/L时，CHO细胞增殖水平受到抑制（P<0.05）。

2.3 不同浓度MTBE对CHO细胞SOD活力的影响 从图2可以看出，经MTBE暴露处理12 h后，CHO细胞的SOD活力随MTBE浓度的升高而升高。当MTBE浓度达到50.0 mmol/L时，CHO处理组SOD活力明显上升，与对照组相比差异显著（P<0.05）。

2.4 不同浓度MTBE对CHO细胞CAT活力的影响 从图3可以看出，MTBE对CHO细胞染毒12 h后，与对照组相比，各处理组CHO细胞的CAT活力出现不同程度升高。当MTBE浓度达到25.0 mmol/L时，CAT活力达到最大值且与对照组差异显著（P<0.05），但随着MTBE浓度的继续升高，CAT活力出现一定程度下降。

2.5 不同浓度MTBE对CHO细胞GSH-Px活力的影响 从图4可以看出，经MTBE暴露处理12 h后，CHO细胞的GSH-Px活力随MTBE浓度的升高而升高，当MTBE浓度达到25.0 mmol/L时，CHO处理组GSH-Px活力明显上升，与对照组相比差异显著（P<0.05）。

3 讨论与结论

MTBE由异丁烯和甲醇化合而成，可以降低汽油的抗爆性、促进汽油充分燃烧，是一种广泛使用的汽油添加剂[8]。在汽油使用过程中，MTBE并不能被完全燃烧，会随汽车尾气排入周围空气中。随着我国汽车保有量的不断增加，汽油消耗量不断增加，最终进入环境中的 MTBE 越来越多。MTBE 易溶于水且较难降解，进入地下水的 MTBE 对自然界造成了持续、广泛的污染，可能对人类生活和健康产生深远的影响[9-10]。近年来，斑马鱼作为模式动物，在国内水体污染监测和控制等方面的应用逐渐受到研究机构的重视，很多国内研究者开展了激素、中药、有毒化学品等对斑马鱼的毒性研究[4]。笔者研究了不同浓度MTBE对斑马鱼的急性毒性作用，发现斑马鱼在100 mg/L MTBE溶液中飼养3 h后开始出现毒性反应，在80 mg/L MTBE试验溶液中饲养6 h后开始出现毒性反应，在60 mg/L MTBE溶液中饲养12 h后开始出现毒性反应，斑马鱼在10～40 mg/L的MTBE、溶剂对照组和空白对照组的试验溶液中饲养48 h，未发现斑马鱼有任何毒性反应。MTBE对斑马鱼的48 h LC50值为71.5 mg/L。该研究结果与Moreels等[11]研究结果相一致。

超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内防御氧化损伤的一种金属酶，能催化ROS产生具有毒性的H2O2，再由CAT分解，2种酶联合清除活性氧自由基，使机体免受氧化伤害，在正常的生理状态下，由代谢活动产生的活性氧可作为抗氧化防御体系。随着MTBE浓度的升高，SOD活力逐渐升高。 Li等[6]将大鼠支持细胞暴露于MTBE，发现SOD活力显著高于未经MTBE暴露的细胞。这与该试验结果相一致，说明在MTBE作用下机体受到胁迫，并诱导SOD活力升高，从而使生物体的生理机能免受损伤。过氧化氢酶（CAT）是一种广泛存在于各类生物体中的酶抗氧化剂，清除体内多余的H2O2，并具有很高的催化效率，从而使细胞免于遭受毒害，是生物防御体系的关键酶之一。随着MTBE浓度的升高，CAT活力逐渐升高，说明MTBE可使CHO细胞产生氧化胁迫，并且CHO细胞受到胁迫后通过提高过氧化氢酶活力来抵御胁迫。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）作为一种重要的过氧化物分解酶，广泛存在于机体中。谷胱甘肽过氧化物酶一方面作为分解酶，能够促进H2O2的分解，另一方面能够将有毒的过氧化物还原成无害的羟基化合物，保护细胞膜。一旦机体处于病理状态，谷胱甘肽过氧化物酶活力水平就会偏离正常范围。因此，检测细胞内GSH-Px活力的改变可以间接了解细胞的损伤情况。MTBE暴露处理可以诱导CHO细胞内GSH-Px活力水平升高，说明细胞可能通过提高GSH-Px活力来进行抵御MTBE诱发的细胞毒性。

综上所述，MTBE暴露对斑马鱼和CHO细胞具有明显的毒性作用，且可以诱导氧化应激相关的酶活力水平提高，说明氧化应激效应可能是MTBE毒性作用之一。

参考文献

[1] PHILLIPS S，PALMER R B，BRODY A.Epidemiology，toxicokinetics，and health effects of methyl tertbutyl ether （MTBE）[J].Journal of medical toxicology，2008，4（2）：115-126.

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[5] JACOCIUNAS L V，DE ANDRADE H H，LEHMANN M，et al.Artichoke induces genetic toxicity and decreases ethyl methanesulfoaterelated DNA damage in Chinese hamster ovary cells[J].Journal of medicinal food，2012，15（10）：873-878.