候鸟基因组DNA分离方法优化

徐红贞　万萍　单兰君

摘要：候鸟分子生物学研究的前提是获得质量好的基因组DNA，采用标准血液DNA提取试剂盒和苯酚-氯仿法分别对采自鄱阳湖的部分候鸟血液进行基因组DNA提取。结果表明，这2种标准方法所获得DNA质量均不合要求，因此在苯酚-氯仿法基础上开展优化试验，得到优化后的苯酚-氯仿法提取条件为组织裂解液500 μL、血液样品20 μL、蛋白酶K 10 μL和酶解时间8 h，在此条件下能分离到高质量的基因组DNA。

关键词：候鸟基因组；分离；优化

中图分类号：Q959.7；Q812 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）11-2145-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.038

Abstract： The premise of migratory bird molecular biology is to obtain high purity and good quality genomic DNA， and the DNA extraction method of common species is not suitable for the isolation and extraction of DNA from migratory birds. The first uses standard blood DNA extraction kit and classical phenol chloroform method genomic DNA blood migratory birds in Poyang Lake were extracted. The results showed that the two standard methods for the quality of DNA are undesirable. Therefore， the optimization test in the classical phenol chloroform method carried out， found that the optimized phenol chloroform method（tissue lysates 500 μL， blood samples 20 μL， proteinase K 10 μL and enzyme hydrolysis time 8 hours），the high quality genomic DNA could obtain under the condition.

Key words： birds genome； separation； optimization

候鸟分子生物学研究的关键是获取高质量和完整的基因组DNA，目前提取基因组DNA的方法较多，实验室提取DNA的方法主要包括苯酚-氯仿法和试剂盒法。试剂盒法是利用核酸在一定浓度溶液条件下吸附固相介质（二氧化硅膜）的原理，在实际操作中采用优化的缓冲体系使裂解液中的DNA高效特异地结合在硅基质离心吸附柱上，通过几次洗涤除去杂质，最后采用低盐缓冲液洗脱获得高纯度DNA。试验中不使用苯酚和氯仿等有毒溶剂，也无需乙醇沉淀等步骤。这种方法的优点是操作简便，耗时短，但其存在离子残留量大的问题，对后续PCR扩增反应尤其是测序反应等造成严重干扰[1]。苯酚-氯仿法是提取基因组DNA最经典方法，其主要原理是根据在水相与酚/氯仿有机相中DNA和杂质的溶解度存在差异而进行分配，通过离心分离出蛋白质等杂质，再利用乙醇沉淀洗涤DNA，最后获得DNA。该方法成本低，所用试剂均为常用试剂，提纯效率高，但不足之处是耗时费力、核酸降解程度大，且所用试剂苯酚和氯仿等具有一定毒性[2]。此外还有盐析法、树脂法、Chelex100法、硅颗粒法、碘化钾法等，每种方法均有优势和不足，有其适应范围。柯柳玉等[3]利用树脂法、酚-氯仿抽提法、盐析法对禽类全血基因组DNA进行提取，结果表明盐析法适合鸡全血DNA的提取，其特点是DNA的浓度和纯度好，耗时短、成本低、操作简单。陈小麟等[4]利用蛋白酶K法、Chelex100法、硅颗粒法对鸟类陈旧标本的羽毛、皮肤、骨骼组织中提取基因组DNA，结果表明Chelex100不适合鸟类标本的DNA提取，蛋白酶K法DNA的提取量大于硅颗粒法。任春环等[5]在提取山羊全血基因组DNA时，通过比较酚-氯仿抽提法和碘化鉀法，发现改良的Miller盐析法操作步骤复杂，耗时更长，苯酚-氯仿法更简便。王洪梅等[6]在提取牛的凝血块基因组DNA试验中，也是采用经典苯酚-氯仿法，然后通过琼脂糖凝胶电泳和PCR检测，发现效果较好，但浓度有些偏低。曹果清等[7]利用组织DNA抽提液而非蛋白酶K对细胞进行裂解，经酚-氯仿抽提后用无水乙醇来沉淀提取DNA，经检测DNA的纯度和浓度均较高。

目前，关于动物血液DNA的提取方法较多，但对候鸟基因组DNA的提取鲜见报道。本试验首先采用通用型柱式基因组提取试剂盒法和苯酚-氯仿法提取候鸟基因组DNA，比较两种方法所分离基因组DNA的质量，筛选适宜的候鸟基因组DNA提取方法，如果结果不理想，进一步优化苯酚-氯仿法以获取最佳分离提取候鸟基因组DNA的方法，以期从分子生物学、遗传多态性方面对候鸟生物特性研究提高参考，为保护濒危候鸟奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于鄱阳湖国家自然保护区野生动物保护站采集若干只候鸟个体的血液（包括白额雁、鸿雁、豆雁、野鸭等品种），采集的血液样品放入-20 ℃冰箱中备用。

1.2 试验试剂

CW2298禽血DNA提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司；Bis-Tris、EDTA和SDS，购自上海生工有限公司；Tris平衡酚，购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖，购自Invitrogen中国公司；三氯甲烷，购自西陇化工股份有限公司；异戊醇和无水乙醇，购自天津市大茂化学试剂厂；蛋白酶K，购自罗氏ROCHE中国公司；RNA酶，购自北京合式金生物技术有限公司。

1.3 DNA的提取方法

1.3.1 试剂盒法 采用康为CW2298试剂盒法提取基因组DNA，试验操作参照禽血DNA提取试剂盒说明书进行。

1.3.2 苯酚-氯仿提取法 苯酚-氯仿法提取基因组DNA试验步骤：取适量鸟类抗凝血样品，加入1 倍体积的组织裂解液，加蛋白酶K，混匀后于55 ℃水浴10 h，离心，上清液置于新的EP管，加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）（体积比）缓慢颠倒摇匀，离心，将上清液移至新EP管；加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）缓慢颠倒混匀，离心；将上清液移至新EP管，加入NaAc和无水乙醇；取白色沉淀，用70%乙醇洗涤3次，除去残留乙醇，室温晾干，加入TE缓冲液溶解基因组DNA，于-20 ℃保存。

1.3.3 优化的苯酚-氯仿提取法 苯酚-氯仿法提取部分候鸟基因组DNA，通过检测分析后发现其RNA、蛋白质残余量较高，有部分DNA降解，而试剂盒提取的DNA离子残留量大，消化不彻底，有些条带不清晰。因此，本试验基于苯酚-氯仿法的候鳥基因组DNA提取优化试验，具体优化参数如表1所示，依次进行细胞裂解液、血液量、消化时间以及蛋白酶K 4个因素的优化试验，且每次试验仅改变一个影响因素，以此不断优化候鸟血液DNA提取试验方案。

1.4 基因组DNA的检测

1.4.1 琼脂糖凝胶电泳 将上述3种提取方法分离的基因组DNA采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。取 2 μL稀释后的DNA与上样缓冲液混匀后加入0.8%琼脂糖凝胶样品孔中，于120 V电泳20 min，电泳后将凝胶置于凝胶成像系统中观察DNA条带，保存图片[8]。

1.4.2 DNA浓度测定 取1 μL提取的基因组DNA，利用ND2000超微量分光光度计测定基因组DNA 样本的OD260 nm、OD280 nm吸光度，计算分析基因组DNA的纯度和浓度[9]。

2 结果与分析

2.1 电泳检测结果

图1为采用禽血试剂盒提取的候鸟基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳结果，可以看出条带亮度不一，有的甚至不清晰，且大部分条带蛋白质残余严重，还存在拖带现象。

图2为采用苯酚-氯仿法提取的候鸟基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳结果，可见带型不整齐，大部分条带不清晰，有些条带蛋白质残留较多，还有拖带现象严重，可能是基因组DNA出现降解、蛋白酶K用量不恰当、组织裂解液用量大，消化时间过长等导致的不良现象。

从上述试验结果可知，禽血DNA提取试剂盒法、苯酚-氯仿DNA提取法所分离到的样本DNA均不理想，不合要求。为此本试验在苯酚-氯仿法基础上进行优化试验，依次对细胞裂解液、血液量、消化时间以及蛋白酶K 4个主要因素的进行优化试验，且每次试验仅改变一个影响因素，优化候鸟血液DNA提取试验方案，最终确定优化后的苯酚-氯仿DNA提取方案为组织裂解液为500 μL、血液样品为20 μL、蛋白酶K为10 μL和酶解时间为8 h。采用该优化方案进行候鸟血液DNA提取，其提取效果如图3所示。从图3可以看出，候鸟基因组DNA条带总体清晰、明亮、无拖带，且基因组DNA无降解，产量较高。

2.2 候鸟血液基因组DNA的浓度和纯度

从表2可以看出，所提取的候鸟基因组DNA的浓度符合要求，均在20 ng/μL以上，纯度A260 nm/A280 mm的比值大部分在1.80～1.90范围内，A260 nm/A230 nm的比值在2.00～2.50范围内，数据表明该DNA杂质含量少，纯度较高，个别样品A260 nm/A280 mm超过了2.00、A260 nm/A230 nm超过了2.50，但是从大量的试验数据来分析，候鸟基因组DNA的浓度和纯度之间不存在必然的联系，浓度为20.8 ng/μL的样品纯度A260 nm/A280 mm为1.81，浓度低不一定是样品不纯造成的。因此，优化后的苯酚-氯仿提取法提取候鸟基因组DNA的效果较好。

3 小结与讨论

为了提高候鸟血液基因组DNA的提取质量，在苯酚-氯仿提取法基础上对反应体系进行优化试验，分析最优的提取方案，细胞裂解液为500 μL、血液样品为20 μL、蛋白酶K为10 μL和消化时间为8 h，获得的候鸟基因组DNA浓度和质量较高。本试验提取了约200只候鸟（主要包括白额雁、鸿雁、豆雁、野鸭等）DNA，并取部分DNA开展了PCR扩增试验，获得理想的扩增效果，可用于进一步的分子生物学试验。

候鸟是有迁徙行为、春秋两季更换栖息地的鸟类。为了更好地从分子角度研究珍稀候鸟的遗传、进化以及对当地家禽的影响，获得质量好、纯度高的血液DNA是关键[10]。因此，有必要选择一种快速、简便、高效的提取候鸟血液DNA的方法。本试验采用禽血试剂盒法和苯酚-氯仿抽提法分别提取基因组DNA，并且对这两种方法进行比较。试剂盒法虽然简便易操作，但得到的候鸟基因组DNA浓度和质量较差，且离子残留量大，影响后续候鸟分子生物学的研究[11]。苯酚-氯仿法提取的DNA电泳图条带模糊，杂蛋白质残留多，拖尾现象严重，不适合下一步研究使用。因此，在苯酚-氯仿法基础上进一步优化了试验条件。鸟类红细胞大多是呈椭圆形，有细胞核结构，因此可以直接提取基因组DNA，但为了不影响所提取基因组DNA的质量，血液样品的量不宜过多[12]。本试验结果表明，当血样样品量为20 μL时，基因组DNA的条带较好。组织裂解液会使血液样品的黏度增大，影响蛋白酶K的催化活性，候鸟基因组DNA的获取量与细胞被裂解的程度相关，当细胞裂解液为500 μL时，基因组DNA条带整齐、集中、无拖尾现象。血液的消化时间是另一关键因素，将直接影响高质量基因组DNA的提取，本试验分别采用消化时间为6、8、10 h，分别提取候鸟血液基因组DNA，比较其电泳结果可知，消化时间为8 h时条带亮度和清晰度较高，也更整齐，说明酶解8 h时的基因组DNA提取效果最好。蛋白酶K的作用是将缠绕在DNA上的蛋白质降解为小分子的肽链或者氨基酸，使DNA完整分离[13]。结果表明，蛋白酶K为10 μL时，DNA条带最好。可见优化后的苯酚-氯仿抽提法可以使基因组DNA充分释放，有效地提高DNA的浓度和质量。

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