瑞舒伐他汀对大鼠脑出血后的C—IAP—1和Caspase—3表达变化影响的研究

祝杰+李廷阳+陆明雄+莫胜勇+冯佳佳+陆钦晨+陆万流

【摘要】 目的 观察大鼠实验性脑出血血肿周围脑组织中C-IAP-1和Caspase-3的表达变化及瑞舒伐他汀的干预作用，探讨瑞舒伐他汀在脑出血发生后可能出现的神经保护作用及其机制。

方法 将60只SD大鼠按照随机分组的方法分为假手术组（A组，20只），脑出血组（B组，20只），瑞舒伐他汀干预组（C组，20只）。每组分成6 h、24 h、72 h、5 d四个时间点，每个时间点使用5只大鼠进行造模并实验。采用自体凝固动脉血注入脑组织法建立脑出血模型。通过实时荧光定量PCR技术测定大鼠脑出血术后4个时间点血肿脑组织C-IAP-1及Caspase-3表达状况。

结果 荧光定量PCR法显示，假手术组、脑出血组与瑞舒伐他汀组术后各个时间点相比，C-IAP-1及Caspase-3表达降低，除第6小时外，其余时间点之间脑出血组和瑞舒伐他汀干预组相比，C-IAP-1表达降低，Caspase-3表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）。

结论 瑞舒伐他汀可以提高C-IAP-1的水平，抑制Caspase-3的水平，提示瑞舒伐他汀能够降低由细胞凋亡影响引起的继发性脑损伤，对神经功能起到一定的保护作用。

【关键词】 脑出血；C-IAP-1；Caspase-3；瑞舒伐他汀

中图分类号：R743.34 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.006

【Abstract】 Objective To observe the change of expression of C-IAP-1 and Caspase-3 in brain tissue around hematoma in rats with experimental intracerebral hemorrhage and the intervention effect of rosuvastatin，and to investigate the neuroprotective effect and possible mechanism of rosuvastatin after intracerebral hemorrhage.

Methods 60 SD rats were randomly divided into sham operation group （group A，20 rats），intracerebral hemorrhage group （group B，20 rats） and rosuvastatin group （group C，20 rats）.Each group was divided into four time points：6 h，24 h，72 h and 5 d，and 5 rats were used for modeling and experiment at each time point.Cerebral hemorrhage model was established by injecting autologous blood into the brain tissue.And the expressions of C-IAP-1 and Caspase-3 in the brain tissue of rats at the 4 time points after intracerebral hemorrhage were measured by RT-qPCR.

Results RT-qPCR showed that expressions of C-IAP-1 and Caspase-3 reduced in the comparison of each time point of the three groups after operation.Expected the 6 h，the expression of C-IAP-1 decreased and the expression of Caspase-3 increased in the cerebral hemorrhage group and the rosuvastatin intervention group at the other time points，so difference was statistically significant（P<0.05）.

Conclusion Rosuvastatin can improve the level of C-IAP-1，and inhibit the effects of Caspase-3，which suggests that rosuvastatin can reduce the secondary brain damage caused by apoptosis，and play a certain role in the protection of nerve function.

【Key words】 intracerbral hemorrhage；C-IAP-1；Caspase-3；rosuvastain

腦出血（Intracerebral Hemorrhage ，ICH）作为神经外科常见疾病，病情一般比较危重，情况较为紧急。目前研究表明在东亚地区中脑出血占脑卒中的比例为25%～55%，在西方国家中相对较少，也达到了10%～15%。有报道指出脑出血发病30天内的死亡率高达40%左右[1]，存活下来的大部分患者致残的概率也达到75%～80%。目前脑出血后继发脑损伤的机制尚未完全阐明，有研究表明出血后引起细胞应激，继而诱导细胞凋亡是重要原因之一。在细胞凋亡过程中Caspase-3被认为起到关键作用[2]，正常细胞中Caspase-3没有活性，其在接收到外界刺激信号后，凋亡程序启动[3]，凋亡开始。凋亡抑制蛋白（inhibitors of Apoptosisprotein，IAPs）主要抑制Caspase3，-7，其可以结合酶原Caspase，进而抑制细胞凋亡[4]。有研究表明瑞舒伐他汀能够通过对血管内皮功能改善、免疫功能调节、抗炎作用等方面阻止兴奋性毒性细胞损伤，在一定程度上抑制细胞凋亡。目前针对瑞舒伐他汀干预下C-IAP-1和Caspase-3在脑出血后表达变化的研究较少，本实验通过对大鼠进行自体凝固血造模，并在瑞舒伐他汀干预下分析大鼠脑出血后C-IAP-1和Caspase-3表达变化，初步探讨瑞舒伐他汀对两种细胞因子的影响，为临床治疗寻找新的可靠方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF级雄性Wistar大鼠60只，体重250～300 g，由武汉云克隆科技股份有限公司（许可证号：SCXK 鄂 2015-0018）提供；瑞舒伐他汀钙片购自阿斯利康药业（中国）有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo公司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）购自Roche公司；荧光定量PCR仪（ABI，型号：7300）；超微量分光光度计（Thermo，型号：NanoDrop2000）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药

将60只大鼠采用随机数字表分为假手术组（A组），脑出血组（B组）以及瑞舒伐他汀干预组（C组）三组，每组20只大鼠。其中每组分成4个时间点，6 h、24 h、72 h、5 d，每个时间点各5只大鼠。B组和C组采用自体凝固动脉血注入法，通过立体定位仪向成年SD大鼠右侧基底节区的尾状核注入凝固自体血，A组采取相同方法注入等量灭菌生理盐水[5～6]。术后2小时按照每kg体重10 mg比例对C组进行灌胃治疗，每天给药一次至造模结束。其余两组同时给予相同量的生理盐水。

1.2.2 模型的建立

大鼠术前禁食禁水6小时，麻醉方式选用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射。尾部采血50 μL，静止5分钟至血液完全凝固。大鼠头顶部行正中纵向切口，30%过氧化氢腐蚀骨膜暴露前囟及进针点。立体定位仪选定靶点，靶点定位于前囟前1 mm、中线左侧旁开3 mm、颅骨外表面下6 mm。进针点处颅骨用颅骨钻钻一个直径1 mm圆孔至硬脑膜表面，微量注射器将凝固血块快速注入靶点内[7～8]（图1），注射速度20 μL/min，留针10 min后取针缝合。A组尾部取血，开颅但不注入自体血，采用相同方法注入等量生理盐水。C组造模后2小时，灌胃给予瑞舒伐他汀（10 mg·kg-1·d-1）1次，A组和B组在相同时间给予等量的生理盐水。模型制备成功的标准是手术后可见大鼠出现明显的对侧肢体瘫痪，同时沿针道冠状切面切开脑组织，可发现颅内血肿形成。

1.2.3 动物的处置、标本采集 采用10%水合氯醛（350 mg/kg），对三组大鼠进行腹腔麻醉，检查麻醉效果即大鼠没有痛觉反应，麻醉成功后为防止大鼠窒息采用止血钳夹住大鼠的下颌及舌防止窒息，取出血肿脑组织，统一放入液氮用于qPCR检测。

1.2.4 引物的设计与合成 从NCBI网上数据库检索基因序列后，由武汉擎科公司设计并合成，C-IAP-1上游引物：5-AGACAGAGTGAAGAGACGGCATC-3，下游引物：5-AGAGAGTTTTTGAAGACGCTGG-3，Caspase-3上游引物：5-GAAAGCCGAAACTCTTCATCAT-3，下游引物：5-ATGCCATATCATCGTCAGTTCC-3。

1.2.5 qPCR实验方法 ①总RNA抽提与逆转录：取脑组织充分碾磨后使用Trizol法提取脑组织中RNA，通过超微量分光光度计检测RNA浓度及纯度，采用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）对总RNA逆转录为cDNA用于C-IAP-1和Caspase-3检测。②qPCR检测C-IAP-1和Caspase-3的表达：引物由武汉擎科创新生物科技有限公司设计并合成，PCR扩增预变性为95℃下10 min，95℃下10 s，60℃ 20 s，74℃ 5 s，循环40次，实时荧光定量PCR仪型号为ABI 7300。③结果处理：采用ΔΔCT法，使用表达倍数=2-ΔΔCT表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用方差分析进行多组间分析，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结 果

2.1 脑出血中C-IAP-1表达 假设A组6 h时间点为1，A组C-IAP-1相对定量数值变化差异无统计学意义（P>0.05），数值基本相同，B组和C组Caspase-3表达水平远高于A组（P<0.01）。C组C-IAP-1在72 h至5 d达到顶峰。C组与B组在各个相同时间点比较，除6 h时间点差异无统计学意义外，其余时间点C组C-IAP-1表达均较B组增加，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1，图2。

2.2 脑出血中Caspase-3表达 假设A组6 h时间点为1，各时间点A组Caspase-3表达水平基本不变，B组和C组Caspase-3表达水平远高于A组（P<0.01）。B组Caspase-3逐渐升高，在24 h至72 h达到顶峰，之后下降。C组与B组在各个相同时间点比较，Caspase-3表达明显减少（P<0.05或0.01）。见表2，图3。

3 讨 论

ICH血肿占位会导致周围脑组织损伤、缺血等，引起炎症反应以及出血产生的血液毒性物質作用下诱导细胞凋亡，从而加重脑损伤程度，脑出血引起的炎症反应导致的细胞凋亡在继发性损伤中的作用日益受到重视[9]。

Caspase即半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，其能够介导细胞凋亡的级联反应。Caspases-3是Caspase家族重要的一员，作为终末剪切酶，Caspase-3在细胞凋亡中起到枢纽的作用，可以裂解DNA依赖性蛋白酶，通过改变其结构导致细胞凋亡产生[10]。目前认为Caspase-3具有高度可变性，能够自发激活或者通过级联反应激活，一旦Caspase-3激活后，就会开始对对应的下游底物进行切割，引起细胞凋亡。近年来钙离子负载引起的内质网受损导致细胞凋亡也越来越受到关注，研究发现内质网受损会引起胞质内Caspase-7转移，诱导Caspase-12表达，Caspase-12会激活Caspase-3，也会导致细胞凋亡发生[11]。

凋亡抑制蛋白是一种能够通过抑制Caspase活性及对NF-κB进行调节来抑制细胞凋亡的内源性抗细胞凋亡因子家族，在对凋亡抑制蛋白（IAP）家族的研究中发现C-IAP-1可以结合并有效地抑制Caspase-3在参与细胞凋亡的部分功能。同样，在体外实验表明，C-IAP-1可以特异结合Caspase-3，抑制Csapase-3的活性，总之，这些研究结果表明，C-IAP-1通过抑制Csapase-3，抑制细胞凋亡基因[12～13]。

瑞舒伐他汀是选择性HMG-CoA还原酶抑制剂的一种，有研究表明瑞舒伐他汀可以起到神经保护作用，通过对血管内皮功能改善、免疫功能调节、抗炎作用等方面阻止兴奋性毒性细胞损伤来降低神经功能缺损[14]。Ridkerbm等人发现坚持服用他汀类药物能够减少缺血性脑卒中致死率[15～16]，他汀类药物能起到促进血液循环，活血化瘀，保护脑功能的作用。

本研究通过荧光定量PCR技术对大鼠脑出血后C-IAP-1和Caspase-3进行研究，发现A组C-IAP-1及Caspase-3表达在四个时间点基本不变，B组和C组C-IAP-1及Caspase-3表达远高于A组，说明脑出血后引起的炎症反应、血液毒性等作用会提高Caspase-3表达，引起神经细胞凋亡，加重脑组织损伤。B组Caspase-3逐渐升高，在24 h至72 h达到顶峰，说明脑出血后会导致Caspase-3表达升高，脑损伤与时间有一定关系。C组C-IAP-1在72 h至5 d达到顶峰，说明瑞舒伐他汀能够促进C-IAP-1的表达，起到保护神经细胞的作用。C组与B组在各个相同时间点比较发现，C组Caspase-3表达水平比B组减少，除6 h时间点外，C组C-IAP-1表达水平均较B组增多。说明瑞舒伐他汀在脑出血发生后可以抑制Caspase-3表达，促进C-IAP-1表达，能够起到抑制细胞凋亡，保护神经细胞，减少脑损伤的作用。

总之，Caspase-3及C-IAP-1在脑出血后引起细胞凋亡中扮演着重要的作用，瑞舒伐他汀能够提高C-IAP-1水平，降低Caspase-3水平起到神经保护作用。但瑞舒伐他汀对C-IAP-1和Caspase-3表达影响的机制尚未完全阐明，随着研究的逐渐深入，其影响的机制也将逐渐清晰，最终将为脑出血治疗增添一个高效的治疗手段。

参 考 文 献

[1] 官 念，吴碧华，刘黎明，等.脑出血病因及相关机制的研究进展[J].中华老年心脑血管病杂志，2016，18（6）：670-672.

[2] Keiko Takaki，Yoshihiro Higuchi，Minako Hashii，et al.Induction of apoptosis associated with chromosomal DNA fragmentation and caspase-3 activation in leukemia L1210 cells by HO2 nanoparticles[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2014，117（1）：129-133.

[3] 蔡 丽，周炼红.Caspase与视网膜细胞凋亡的研究进展[J].临床眼科杂志，2016，24（4）：380-383.

[4] 吴志伟，陈 凯，段卫明，等.凋亡抑制蛋白XIAP和Survivin在晚期胃癌中的表达及其与含多西紫杉醇方案化疗疗效的相关性[J].现代肿瘤医学，2015，23（6）：815-820.

[5] 李新明，方显明.安心颗粒对心衰大鼠血流动力学及STAT3信号传导通路的影响[J].广西中医药，2010，33（3）：47-49.

[6] 朱文丽.大鼠实验性脑出血急性期Notch1与NF-κB的表达变化及他汀的干预作用[D].长沙：中南大学，2014

[7] 阮志芳.大鼠脑内注射凝血酶对小胶质细胞活化及诱导型一氧化氮合酶表达的影响[D].福州：福建医科大学，2009.

[8] 吕田明，陆兵勋.大鼠尾状核注射凝固自体动脉血脑出血模型[J].中风与神经疾病杂志，2006，23（1）：88-90，129.

[9] 王立姝.TLR4对大鼠脑出血后炎症反应和神经细胞凋亡的作用研究[D].沈阳：中国医科大学，2009.

[10] 傅锦华，刘 勇，王清勇，等.舒肝解郁胶囊对抑郁模型大鼠海马神经元凋亡及脑组织caspase-3蛋白表达的影响[J].中南大学学报（医学版），2012，37（12）：1198-1204.

[11] 焦东亮，倪秀石，高 艳，等.丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后caspase-3表达的影响[J].中国临床神经科学，2007，15（1）：19-23.

[12] HUANG Li Hua，YANG Huan，SU Xin，et al.Neodymium Oxide Induces Cytotoxicity and Activates NF-κB and Caspase-3 in NR8383 Cells[J].Biomedical and Environmental Sciences，2017，30（1）：75-78.

[13] Karine Sá Ferreira，Clemens Kreutz，Sabine MacNelly，et al.Caspase-3 feeds back on caspase-8，Bid and XIAP in type I Fas signaling in primary mouse hepatocytes[J].Apoptosis，2014，17（5）：503-515

[14] 涂征艷，石 硕，李玉梅.化滞柔肝颗粒联合瑞舒伐他汀钙治疗脂肪肝的疗效观察[J].中国医药科学，2012，2（23）：72-73.

[15] Sinar EJ，Mendelow AD，Graham DI，et al.Experimental intracerebral hemorrhage：effects of a temporary mass lesion[J].J Neurosurg，l987，66（4）：568-576.

[16] Ridker PM，Danielson E，Fonseca FA，et al.Rosuvastatin to prevent vascular events in men and women with elevated C-reactive protein[J].N Engl J Med，2008，359（21）：2195-2207.

（收稿日期：2017-03-17 修回日期：2017-04-13）

（编辑：潘明志）