ESAT—6、INF—γ对老年结核性脑膜炎患者的临床意义

张虹+邹金艳+叶丽君

摘要：目的 探讨结核分枝杆菌早期分泌性抗原-6（ESAT-6）和干扰素-γ（INF-γ）对老年结核性脑膜炎患者的临床意义。方法 选取2013年1月～2016年12月住院治疗的老年结核性脑膜炎患者11例，非感染性神经系统疾病患者15例。采用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测患者的ESAT-6和INF-γ水平并比较。结果 老年结核性脑膜炎患者的ESAT-6、INF-γ水平较对照组明显升高（P<0.05）。结论 检测ESAT-6、INF-γ水平对诊断老年结核性脑膜炎具有重要临床意义。

关键词：ESAT-6；INF-γ；结核性脑膜炎

中图分类号：R529.3 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）13-0056-02

Abstract：Objective To investigate the clinical significance of early secretory antigen-6（ESAT-6）and interferon-γ（INF-γ）of Mycobacterium tuberculosis in elderly patients with tuberculous meningitis.Methods Eleven patients with tuberculous meningitis were enrolled in this study from January 2013 to December 2016，and 15 patients with non-infectious neurological diseases were enrolled.The levels of ESAT-6 and INF-γ were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results The levels of ESAT-6 and INF-γ in elderly patients with tuberculous meningitis were significantly higher than those in the control group（P<0.05）.Conclusion The detection of ESAT-6 and INF-γ levels is of great clinical significance in the diagnosis of elderly patients with tuberculous meningitis.

Key words：ESAT-6；INF-γ；Tuberculous meningitis

结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是全球流行性疾病，是最严重的肺外结核病，占结核病死亡病因的首位[1]。隨着人口老龄化的加剧，老年TBM患者逐渐增多，并因其发病隐匿、临床症状不典型、免疫功能减退、各脏器功能衰退、合并多种疾病等特点，使得老年TBM的诊治面临更多挑战。本研究通过检测11例老年结核性脑膜炎患者的结核分枝杆菌早期分泌性抗原-6（early secreted antigenic target 6，ESAT-6）、干扰素-γ（interferon-γ，INF-γ）水平并探讨其临床意义，为临床提供更多理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2013年1月～2016年12月在台州市第一人民医院住院治疗的老年TBM患者11例（TBM组），男7例，女4例，平均年龄（65.7±4.8）岁。对照组为同期住院治疗的老年非感染性神经系统疾病患者15例，男10例，女5例，平均年龄（66.2±5.3）岁。两组患者性别构成、年龄等一般资料对比无明显差异（P>0.05）。

1.2诊断标准

年龄>60岁，且符合以下结核性脑膜炎诊断标准[2]的病例纳入本研究：①临床表现有发热、头痛、呕吐、意识障碍，存在脑膜刺激征或伴有局灶性神经损害；②脑脊液检查显示白细胞数增加，蛋白含量增高，糖和氯化物浓度降低，墨汁染色无隐球菌，革兰染色未见细菌和真菌，脑脊液细菌和真菌培养阴性；③颅脑CT或MRI检查发现脑积水、脑基底池渗出、脑梗死；④存在颅外结核，如肺结核、肾结核等；⑤抗结核治疗有效；⑥排除其他神经系统疾病。

1.3标本采集

所有患者入院24 h内排除腰穿禁忌症后，在无菌条件下腰椎穿刺采集脑脊液2管，一管用于脑脊液常规和生化检测，当天完成；另一管3000 r/min离心10 min，取上清液-20℃储存，用于检测ESAT-6和INF-γ。

1.4标本检测

采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA法）检测ESAT-6和INF-γ水平，ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，根据试剂盒说明书操作，建立标准曲线，采用Rayto-6100酶标仪检测吸光度，根据标准品线性回归曲线计算各样本浓度值。

1.5统计分析

采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1老年TBM患者脑脊液常规和生化特点

老年TBM患者脑脊液白细胞计数、蛋白质浓度及腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）水平明显高于对照组（P<0.05），脑脊液葡萄糖、氯化物浓度明显低于对照组（P<0.05），见表1。TBM组和对照组白细胞计数、葡萄糖、氯化物、蛋白质、ADA水平均符合结核性脑膜炎和非感染性神经系统疾病患者脑脊液常规和生化改变的典型特征，具有代表性和研究意义。

2.2老年TBM患者ESAT-6和INF-γ水平检测

老年TBM患者ESAT-6和INF-γ水平均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

3讨论

1882年德国细菌学家罗伯特科赫首次发现结核杆菌并证实其为结核病的病原菌，随后人类逐渐重视并深入研究结核杆菌及结核病，但由于多重耐药、合并感染人类免疫缺陷病毒等多种因素，结核病的发病率和死亡率依然堪忧，结核杆菌感染的早期诊断和有效治疗仍然是全球性的挑战。

TBM是由结核杆菌感染引起的脑膜和脊髓膜的非化脓性炎症性疾病，病变可累及脑实质、蛛网膜、软脑膜、脑血管等，伴或不伴肺结核、肾结核、骨结核等其他部位结核病，是常见肺外结核病之一[3]。典型的TBM患者可有结核接触史，有中枢神经系统外结核病灶，有低热、盗汗、消瘦等结核中毒症状，有发热、头痛、呕吐和脑膜刺激征，可出现颅内压增高表现，病变进展还可引起脑神经损害，导致不可逆性中枢神经系统损伤。老年TBM患者容易合并颅外结核，脑血管等基础疾病多，起病隐匿，缺乏典型脑脊液改变，临床表现复杂多样化，容易误诊、漏诊，是临床诊治和实验室诊断的共同难点。

脑脊液检查是TBM重要的实验室检查手段，传统的脑脊液检查方法包括脑脊液细胞学（白细胞计数、细胞分类等）、脑脊液生化（糖、氯化物、蛋白质、ADA等）、脑脊液涂片抗酸染色、脑脊液培养等。ADA是核酸代谢中的一种关键酶，广泛存在于肝、肺、骨骼等组织中，肝损伤、肿瘤等疾病均可升高，缺乏特异性。ADA是TBM的常规检查项目，可用于鉴别结核和其他感染性脑膜炎。TBM患者脑脊液一般为无色，白细胞计数增高，以淋巴细胞为主，蛋白质定量、葡萄糖、氯化物和ADA增高，本研究数据中TBM患者脑脊液常规和生化检测的特点与之相符。但脑脊液细胞学和生化改变缺乏特异性，容易受较多因素影响，不适于TBM的确诊。脑脊液涂片抗酸染色和脑脊液培养是TBM诊断的金标准，但其敏感性低，无法满足临床需求。分子生物学方法如PCR，敏感性偏低，存在假阳性率，对实验室条件有一定要求，检测结果容易受操作者影响。Ruiz-Hernandez G的Meta分析[4]显示，结核杆菌DNA扩增试验敏感性为56%，特异性98%，DNA扩增试验阴性不能排除结核感染。研究表明，TBM患者PCR检测结果变异系数大，敏感性33%～90%，特异度88%～100%。结核感染T细胞斑点试验（T-spot）是一种敏感性和特异性均较高的新的结核病免疫学诊断方法，但诊断TBM敏感性较低。总之，目前应用于临床的免疫学、细菌学和分子生物学方法都存在敏感性过低或特异性偏低的问题。因而，我们需要寻找一个敏感性和特异性都能满足临床需求的新的、经济的指标。

ESAT-6是结核杆菌在病变早期分泌的一种蛋白，包含95个氨基酸，分子量为9.975kDa，编码基因位于D1区[5]。IFN-γ是由单核细胞、淋巴细胞等产生的具有多种功能的活性蛋白质，可以调节免疫功能、影响免疫细胞的增殖和活化。ESAT-6在正常人体内含量很低，一旦结核分枝杆菌大量繁殖，ESAT-6含量迅速增高，高表达的ESAT-6可以刺激机体产生IFN-γ等细胞因子，发挥免疫调节作用，影响结核的病程进展和预后转归。另外，卡介苗和非致病性环境分枝杆菌均不分泌ESAT-6，接种卡介苗不会引起假阳性，非结核分枝杆菌感染不会引起ESAT-6升高。因而，ESAT-6是结核分枝杆菌较特异的抗原，适合于临床检测。IFN-γ是TBM病程中由ESAT-6等多种因素刺激产生，研究表明[6]，TBM患者脑脊液中分泌IFN-γ的特异性T细胞明显高于外周血，同时检测IFN-γ有助于TBM辅助诊断。

国内外已有ESAT-6和INF-γ在结核性脑膜炎中应用的相关报道。陈子松[7]等的研究表明，ESAT-6和INF-γ在儿童结核性脑膜炎中明显升高，具有重要早期诊断價值。张春晓[8]等通过研究49例结核性脑膜炎患者发现，ESAT-6诊断结核性脑膜炎的敏感性为89.80%，特异度为96.43%，曲线下面积为0.876。Feng GD[9]等报道了280例疑似患者的研究，发现ESAT-6诊断结核性脑膜炎的敏感性为75.1%，特异性为90.0%。Song FX等[10]用免疫组化方法检测脑脊液单核细胞中的ESAT-6，结果发现，TBM患者发病第1 w和第2 w脑脊液中ESAT-6阳性细胞明显高于第4周，ESAT-6在TBM的早期诊断中的敏感性和特异性分别为90%和92%。杨璟[11]检测了46例TBM患者脑脊液单核细胞内的ESAT-6抗原，发现ESAT-6诊断TBM的灵敏度为91.30%，特异度92.5%，假阳性率7.5%，假阴性率8.70%，阳性预测值93.33%，阴性预测值90.24%。

本研究显示，与对照组相比，老年TBM患者的ESAT-6和INF-γ水平显著升高（P<0.05），可用于老年患者结核性脑膜炎的辅助诊断。另外，本研究采用ELISA方法检测TBM患者脑脊液ESAT-6和INF-γ，检测方法成熟，操作简便，可以定量检测，易于基层医院推广，有深入研究开发价值。

综上所述，脑脊液ESAT-6和INF-γ检测对于老年结核性脑膜炎患者具有一定诊断价值，可以减少误诊和漏诊，给临床诊断提供更多参考。

参考文献：

[1]朱海兵，欧阳桂兰，余海.老年结核性脑膜炎的临床分析[J].中华老年心脑血管病杂志，2015，18（7）：754-755.

[2]贾建平，陈生弟.神经病学[M].第7版.北京：人民卫生出版社，2013.

[3]Isabel BE，Rogelio HP.Pathogenesis and immune response in tuberculous meningitis[J].Malays J Med Sci，2014，21（1）：4-10.

[4]Ruiz-Hernandez G，Gonzalez A，de Juan R，et al.Diagnostic accuracy of semiquantitative analysis of positron emission tomography in radiologically indeterminate lung lesions[J].Rev Esp Med Nucl，2002，21（1）：403-409.

[5]Gupta N，Vedi S，Kunimoto DY.Novel lipopeptides of ESAT-6 induce strong protective immunity against Mycobacterium tuberculosis：Routes of immunization and TLR agonists critically impact vaccine's efficacy[J].Vaccine，2016，34（46）：5677-5688.

[6]Thomas MM，Hinks TS，Raghuraman S，et al.Rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis meningitis by enumeration of cerebrospinal fluid antigen-specific T cells[J].Int J Tuberc Lung Dis，2008，12（6）：651-657.

[7]陈子松，李磊，周杭杰，等.ESAT-6、INF-γ和ADA在结核性脑膜炎早期诊断中的应用[J].浙江临床医学，2015，17（7）：1173-1174.

[8]张春晓，鲁广建，王永亮.脑脊液单核细胞早期分泌性抗原靶-6联合脑脊液阿拉伯糖甘露糖脂抗体对结核性脑膜炎的诊断价值研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2015，23（7）：15-19.

[9]Feng GD，Shi M，Ma L，et al.Diagnostic accuracy of intracellular mycobacterium tuberculosis detection for tuberculous meningitis[J].Am J Respir Crit Care Med，2014，189（4）：475-481.

[10]Song FX，Sun XW，Wang XT，et al.Significance of mycobacterium tuberculosis antigen expression in cerebrospinal fluid monocytes in diagnosingtuberculous meningitis[J].Indian J Pathol Microbiol，2014，57（2）：265-268.

[11]楊璟.检测脑脊液单核细胞内结核分支杆菌早期分泌性抗原对结核性脑膜炎的诊断价值[J].实用医院临床杂志，2014，11（1）：84-86.编辑/杨倩