MicroRNAs与异种移植

赵智成

摘要：MicroRNAs是一种普遍存在的非编码单链RNA，广泛参与众多的生物学过程，特别是对免疫系统能够进行精细调节和定量调节。异种移植是治疗脏器功能衰竭的希望。研究MicroRNAs在免疫调节应答中的作用，将为防治移植排斥反应提供新的途径。

关键词：MicroRNAs；异种移植；免疫调节；排斥反应

中图分类号：R392.4 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）13-0044-03

1 MicroRNAs的研究现状

近年来测序技术、生物信息学以及基因组学的飞速发展带来了巨量的遗传信息，使人们认识到基因表达和调节机制的重要性。1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4[1]。2000年，Reinhart等又在该线虫中发现第二个异时性开关基因let-7[2]。2001年10月《Science》报道了三个实验室分别从线虫、果蝇和人体内找到的几十个类似于lin-4的小RNA基因，称之为MicroRNAs。在过去的十年中，MicroRNAs作为细胞基因调节网络的核心元件这一事实越发的清晰。MicroRNAs家族是一类内源性、非编码、单链RNA，长约22个核苷酸，作为一种转录后的基因调节因子而广泛存在于从病毒、线虫、植物到动物体内。MicroRNAs通过和匹配的互补mRNA结合或促进靶mRNA降解来阻断翻译过程进而抑制蛋白的合成。MicroRNAs被一组的基因编码，在细胞核内表达，经过一系列的加工变为长为19～25核苷酸的成熟体。首先在核内，较长的包含特征性发卡结构的MicroRNAs初级转录产物（primary MicroRNAs）被RNA聚合酶II转录并被核糖核酸酶III、Drosha内切酶及Parsha/DGCR8加工成70个核苷酸左右并能形成茎环结构的前体（pre-MicroRNAs）[3]。而后，pre-miRNAs被转运子5转移到胞浆内，并被Dicer酶及其配体TAR RNA结合蛋白（TRBP）加工成22核苷酸的双链RNA。双链RNA解离后形成有功能的、成熟的MicroRNAs单链，后者与包括Argonaute族在内的众多蛋白组成RNA介导的沉默复合体（RISC），从而发挥抑制靶mRNA转录及促进其降解的作用。揭开MicroRNAs的沉默翻译网络之谜在某种程度上仍是一项挑战，这是因为一种MicroRNAs可以抑制多种靶mRNA，同时一种mRNA又接收多种相互合作的MicroRNAs的调控。与之相应，尽管已知MicroRNAs的表达、功能失调与多种人类肿瘤和自身免疫性疾病相关，但对于MicroRNAs的调控机制我们仍然知之甚少。其直接参与了广泛的生物学过程，包括生长发育、造血、细胞分化、凋亡及增殖。迄今为止，超过800种人类MicroRNAs被鉴别，而只有其中一小部分的生物学功能被阐明。到目前为止，通过某些计算机手段预测出来的MicroRNAs约多达1000个甚至可能更多，大约覆盖了3%人类基因组序列[4-6]。

2 MicroRNAs的鉴别和检测

鉴别和检测MicroRNAs的三项主要技术：总MicroRNAs测序、总MicroRNAs芯片检测及实时定量PCR（qPCR）对于假定MicroRNAs的直接检测。测序最为敏感，可发现新的MicroRNAs。常规cDNA克隆后测序和深度测序[7]被用于鉴别新MicroRNAs。存在多種MicroRNAs芯片如MicroRNAs微芯片、qPCR芯片，尽管它们只能用于已知MicroRNAs的检测[8-11]，商品化的试剂盒可被有效用于基于杂交和qPCR的MicroRNAs表达分析。最后，直接的qPCR用于对已知MicroRNAs的快速检测。带有茎环的逆转录引物增加了对于MicroRNAs检测的特异性及敏感性[12]。

3 MicroRNAs的功能

3.1 MicroRNAs功能与表达的关系

MicroRNAs的功能分析主要包括对MicroRNAs表达的调节和对靶mRNA表达的影响。慢病毒及逆转录病毒载体常被用于高表达MicroRNAs，而后对其靶mRNA的表达进行分析[13]。常用的策略是使用含有MicroRNAs靶序列的荧光素酶报告系统来检测过表达pri-miRNA或用shRNA、siRNA抑制时靶mRNA的表达情况。其它减低MicroRNAs表达的方法还有MicroRNAs基因敲除和序列特异性的MicroRNAs拮抗物[14]。绝大多数MicroRNAs的靶mRNA还不清楚，确定某一特定的MicroRNAs的靶基因及结合位点仍是一大挑战。基因芯片和靶基因预测软件可用于这一工作[15-16]。据估计至少有一半表达的mRNA被MicroRNAs所调控[17]。通过荧光素酶报告系统，这些mRNA将被确认其非翻译区（UTRs）是否被特定的MicroRNAs所调控[18]。而MicroRNAs在人工系统中能够调节某一mRNA并不能说明在体内后者是前者功能相关的靶mRNA[19]。

3.2 MicroRNAs功能与免疫系统调节的关系

动物免疫系统在应对感染、内环境稳定和免疫方面发挥重要作用。为了达到免疫反应和免疫耐受的适当平衡，免疫反应的开始、结束和反应强度必须被严密调节。相较于转录子全开或全闭的调节方式，MicroRNAs更适合对免疫系统进行精细和定量的调节。因为它们都是通过极短的作用位点进行调节，在对应位点一个或几个碱基对就可以起到关键的作用，并且因为它们在进化中易于突变，从而为生物提供了随病原体变化同时又发挥作用的基因调节库。最近研究表明MicroRNAs在免疫系统的精密调控中发挥了重要作用。深入理解免疫系统被MicroRNAs调节的机制，不仅有利于寻找调节免疫的新靶标，也有利于创造MicroRNAs有效地新疗法。MicroRNAs在免疫系统发育及功能中起到了关键作用。某些特定MicroRNAs对B细胞、T细胞分化，先天及获得性免疫，T细胞受体（TCR）通路，toll样受体（TLR）通路，调节性T细胞（Treg）功能，抗原的表达及细胞因子的产生都具有巨大影响。因此，MicroRNAs参与了免疫的各个方面并可以决定移植物的排斥与耐受，尽管这一论点须在移植模型中作进一步证实。

4 異种移植的排异反应

器官移植已成为脏器功能衰竭的一种重要疗法，环孢素等抗排斥药物的出现以及手术技术的进步使器官移植取得了里程碑式的进展。然而，移植供体日渐缺乏。临床上如果能够开展异种移植，则可为患者提供大量的供体，移植技术也将得到极大的推动。异种移植完成后受体将表现出比同种移植更为复杂而强烈的排异反应。包含：超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR）、急性血管性排斥反应（acute vascluar rejection，AVR）、急性细胞性排斥反应（acute cellular rejection，ACR）等。其中，HAR主要由半乳糖α1，3-半乳糖抗原（Galα1，3Gal）所引发，而急性血管排斥反应和急性细胞排斥反应与核转录因子-κB（NF-κB）有着密切关系。AVR发生于HAR后，又称延迟移植排斥反应（delayed xenograft rejection，DXR），AVR有2个特点，其一是激活血管内皮细胞以及单核细胞浸润，很少出现T细胞或缺少T细胞，表明AVR并不依靠补体参加。此反应是通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用以及供体内皮细胞活化等几种机制来完成。有研究证明，3个因素或许参与AVR的发生、发展：天然异种抗体、继发抗体的结合、激活的供体内皮细胞和针对异源组织的NK细胞活化。

5 MicroRNAs与异种移植的关系

当我们开始认识到MicroRNAs在参与免疫应答中有怎样的特异性时，有证据表明MicroRNAs参与了整个免疫稳态和自身耐受的维持。此外，MicroRNAs表达的方式和水平依淋巴细胞的分化和活化而进行高度调节。既然特定基因的表达模式可以作为移植物排斥或耐受的标志，那么有理由认为MicroRNAs表达的变化便是这种模式的基础。Suthanthiran的研究小组测定了365种MicroRNAs在7份同种异体肾移植物活检标本中的表达模式并分析了特定MicroRNAs在其它33份标本（12份急排、21份正常）的表达情况。聚类分析表明急排组与正常组有差异。17种MicroRNAs在急排活检标本和正常对照间表达有差异。与正常对照相比，10种低表达，7种高表达。miR-142-5p，miR-155和miR-223高度提示急排并且与移植物内CD3 mRNA水平相关。miR-155被证明与抗体、细胞因子产生，TLR信号通路，Treg细胞生成相关，而所有这些都关系到同种异体移植物排斥反应。这3个MicroRNAs基因簇位点是：miR-648、miR-185、miR-130b同位于染色体22q11，21；miR-510、miR-513位于染色体xq27，3；miR-370、miR-494、miR-134、miR-433位于染色体14q32，31。通过软件TargetsScan可以预测差异表达显著的MicroRNAs靶基因，从中寻找慢性排斥的可能影响因子进行进一步的研究探索。由此可见，MicroRNAs在移植排斥反应中发挥着重要的调控作用。

6 小结

未来几年的研究工作将集中在阐明特定MicroRNAs的靶基因及其生物学重要性。在这一领域的进展无疑将使我们对于免疫应答的理解更近一步从而为器官移植提供了新的靶点和途径。事实上，静默靶MicroRNAs的相关策略已经被开发-即使用“拮抗mirs”，一种与靶MicroRNAs互补的胆固醇结合的单链RNA寡核苷酸。其它的方法包括使用载体介导的MicroRNAs靶序列诱导并耗竭内源性的mRNAs。另外，使用腺病毒载体替代靶MicroRNAs的方法对鼠肝细胞癌模型起到了治疗作用。未来对MicroRNAs在调节免疫应答中表达和功能的进一步认识必将为促进移植物长期存活提供新的可能性。

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編辑/成森