鲤鱼鱼鳞蛋白的酶解制备工艺及其抗氧化活性

2017-07-10李美娜黎德佳谢景李婷婷

安徽农业科学 2017年19期

李美娜　黎德佳　谢景　李婷婷

摘要[目的]确定鲤鱼鱼磷蛋白的酶解制备工艺，并分析所得的鱼磷抗氧化肽的抗氧化性能。[方法]以鲤鱼鱼鳞为原料，

选用胰蛋白酶考察其加酶量、反应温度、酶解时间、pH、底物浓度等因素对鱼鳞蛋白水解程度的影响，

用单因素及正交试验的方法优选出鱼鳞蛋白酶解的最佳条件并测定其抗氧化活性。[结果]试验得到鲤鱼鱼磷抗氧化肽酶法制备的最佳工艺条件为pH 8.4、酶解温度45 ℃、加酶量4000 U/g、酶解时间3 h、底物浓度15%，此条件下得到的鱼磷抗氧化肽水解度较佳（29.97%），抗氧化能力较好。[结论]胰蛋白酶有溶解鲤鱼鱼鳞蛋白的能力，并且酶解产物的抗氧化活性与水解度有关。

关键词鲤鱼鱼鳞；酶解；水解度；抗氧化活性

中图分类号S986；TS254文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）19-0086-04

Study on Enzymatic Hydrolysis Preparation and Antioxidant Activity of Protein from Carp Scales

LI Meina，LI Dejia，XIE Jing，LI Tingting*

（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian，Liaoning 116600）

Abstract[Objective] To determine enzymatic hydrolysis preparation technique of protein from carp scales and study its antioxidant activity.[Method] With carp scale as material，using trypsin to study effects of enzyme dosage，temperature，time，pH，substrate concentration on hydrolysis degree of scale protein.Single factor and orthogonal test were adopted to select the optimum conditions of enzymatic of protein from carp scales and determine its antioxidant，activity.[Result] Under the conditions of pH 8.4，temperature 45 ℃，enzyme dosage 4 000 U/g，time 3 h，substrate concentration 15%，the degree of hydrolysis and antioxidant activity were better.The degree of hydrolysis of trypsin reached 29.97%.[Conclusion] Trypsin had the ability to dissolve carp protein，and the antioxidant activity of hydrolysates was related to the degree of hydrolysis.

Key wordsCarp scales；Enzymatic hydrolysis；Degree of hydrolysis；Antioxidant activity

近十幾年来，我国水产养殖业和水产品加工业蓬勃发展。据统计，2011年我国淡水鱼产量为2 343.66万t，2012年我国淡水鱼产量为2 497.71万t，2013年我国淡水鱼产量为2 635.08万t，其中有鳞鱼1 310万t以上，而我国每年大约可产生鱼鳞高达65万t，但除了少部分被加工成饲料外，大部分的鱼鳞都被抛弃浪费了[1]。这不仅造成了资源了巨大浪费，同时也污染了环境。鱼鳞中含有丰富的蛋白质和多种矿物质，研究表明，鱼鳞具有延缓衰老、降低血清总胆固醇、促进血液循环和预防心脏病及高血压等功效[2-3]。美国免疫学家证实，用鱼鳞提取物制成的抗癌药62硫化鸟嘌呤治疗白血病，有效率达70%以上，其对胃、淋巴癌也有较好的治疗效果[4]。鱼鳞中的蛋白质含量高达70%，主要是胶原蛋白和鱼鳞硬蛋白，鱼鳞胶原蛋白中含有丰富的甘氨酸和脯氨酸，其水解产物含有大量的生理活性肽，在保健和美容方面具有很大的应用前景。胶原蛋白中含有大量的疏水性氨基酸，经酶解后，含疏水氨基酸的肽大量释放出来，参与到酶解产物的抗氧化过程中，使得其具有较强的抗氧化作用[5-6]。

由于利用胰蛋白酶在此方面的研究较少，所以该研究旨在利用胰蛋白酶对鲤鱼鱼鳞进行酶解，以羟自由基清除率和水解度为指标，确定鲤鱼鱼鳞抗氧化肽酶法的最佳工艺条件，并对在此条件下制备的鱼鳞抗氧化肽进行分析，为以后鱼鳞的酶解和抗氧化性能的研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料。鲤鱼鱼鳞购于当地水产市场，胰蛋白酶，酶活力250 000 U。

1.1.2主要试剂。去离子水；0.4 mol/L氢氧化钠溶液；0.2 mol/L盐酸溶液；甲醛溶液；硫酸铜；硫酸钾；浓硫酸；混合指示剂；0.049 mol/L的盐酸溶液；20 g/L硼酸溶液；羟自由基清除能力测试盒，苏州科铭生物技术有限公司。

1.1.3仪器设备。电子天平；可见分光光度计；离心机；pH计；烘箱；搅碎机；数显水浴锅；磁力搅拌器；电磁炉；凯氏定氮装置；通风橱；酶标仪。

1.2方法

1.2.1鲤鱼鱼鳞酶解制备工艺流程。

鲤鱼鱼鳞→清洗、烘干→浸酸（0.2 mol/L，M/V=1∶20、36 h）→清洗至中性→烘干→浸碱（0.4 mol/L、M/V=1∶15、12 h）→清洗至中性→烘干→打碎→鱼鳞+水→沸水浴加热（100 ℃、15 min）→冷却→调节pH（NaOH/HCl） →预热30 min →加酶→恒温水解4～9 h→灭酶（100 ℃、10 min）→冷却→离心（11 000 r/min、15 min、4 ℃）→取得上清液备用。

1.2.2鱼鳞中总氨基态氮的测定。

总氨基态氮含量的测定采用点位滴定法。取鱼鳞水解液20 mL，定容至100 mL。取定容好的样品20 mL于250 mL烧杯中，然后再加入60 mL水，放到磁力搅拌器上持续搅拌，用0.05 mol/LNaOH标准液将溶液pH滴定至8.2，再加入10 mL甲醛溶液，待混匀后，再用0.05 mol/L NaOH溶液继续滴定至pH 9.2，滴定所用NaOH溶液的量即为V1，可代入公式（1）计算。在滴定之前要用此法做试剂空白试验，滴定所用NaOH溶液的量即为V2，可代入公式（1）中计算。

X=（V1-V2）×C×141 0005×V3100×1 000×1 000（1）

式中，X为样品中总氨基氮含量（mg/L）；V1为加入甲醛后样品稀释液消耗氢氧化钠的体积（mL）；

V2为试剂空白试验加入甲醛后样品稀释液消耗氢氧化钠的体积（mL）；V3为样品稀释液的取用量（mL）；

C为氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）。

1.2.3总氮含量的测定。

总氮的含量测定采用GB/T 5009.5—2003蛋白质测定中的凯氏定氮法。

1.2.4鱼鳞肽水解度（DH）的测定。以水解液中的氨基态氮与原料中的总氮的分数表示：

DH=水解液中氨基态氮含量原料中总氮含量×100%

水解度能夠有效地反映出不同的蛋白酶在不同的条件下对鲤鱼鱼鳞水解程度的差异。

1.2.5改良的羟自由基清除率的测定[7]。

选用羟自由基清除能力测试盒进行测定。羟自由基清除率的计算见公式（2）：

D=（A2-A1）（A3-A1）×100%（2）

式中，A1为标准管的吸光值；A2为测定管的吸光值；A3为空白管的吸光值。

1.2.6胰蛋白酶酶解条件的确定。

单因素试验：每次取10 g鱼鳞，在用胰蛋白酶酶解鱼鳞的过程中分别考察不同影响因素对鱼鳞水解度的影响。影响鱼鳞蛋白水解度的条件主要包括水解的pH、酶的添加量、水解温度、底物浓度和水解时间。通过变量分析的方法，从而确定各个因素对鱼鳞蛋白水解程度的影响及其最适范围，为接下来的正交试验做准备。

正交试验：在单因素试验的基础上，选定了pH（A）、水解温度（B）、酶添加量（C）、酶解时间（D）和底物浓度（E）各因素的3个水平（从单因素最适条件中选择），分别以水解度和羟自由基清除率为指标，设计了L18 （35）的正交试验并确定各因素的最佳条件。胰蛋白酶的正交试验设计见表1。

2 结果与分析

2.1胰蛋白酶水解鲤鱼鱼鳞各因素对水解度的影响

2.1.1pH对胰蛋白酶水解度的影响。已知胰蛋白酶的最适pH在7.8～8.5，所以便在此范围内对胰蛋白酶进行进一步研究。在酶添加量5 000 U/g、底物浓度15%、酶解温度50 ℃、酶解时间5 h，不同pH下水解度的变化曲线见图1。由图1可得出，水解度在pH为7.8～8.0的范围内逐渐增大，pH在8.0后逐渐减小，而在pH 8.2后又处于增加的状态，在pH为8.4时出现第2个峰。其中pH为8.0、8.1、8.4的水解度较大，所以选择这3个条件做接下来的正交试验。

2.1.2酶添加量对胰蛋白酶水解度的影响。

在底物浓度15%、酶解时间5 h、pH 8.0、酶解温度50 ℃、不同酶添加量下水解度的变化曲线见图2。由图2可得出，水解度先随加酶量的增多而增大，酶添加量在4 000 U/g后处于逐渐减小的趋势，而在酶添加量为8 000 U/g的时候出现了显著地增大。其中酶添加量为4 000、5 000、8 000 U/g的水解效果较好，所以选用这3个条件做接下来的正交试验。

安徽农业科学2017年

2.1.3酶解温度对胰蛋白酶水解度的影响。

在底物浓度15%、酶解时间5 h、pH 8.0、酶添加量4 000 U/g、不同酶解温度下水解度的变化曲线见图3。由图3可得出，水解度在酶解温度为35～40 ℃时增加幅度较大，而酶解温度在40 ℃时，随温度的升高水解度逐渐较低。其中酶解温度为40、45、50 ℃时的水解效果较好，所以选用这3个条件做接下来的正交试验。

2.1.4底物浓度对胰蛋白酶水解度的影响。

在酶解温度40 ℃、酶解时间5 h、pH 8.0、加酶量4 000 U/g、不同底物浓度下的水解度变化曲线见图4。由图4可得出，不同底物浓度的水解度从大到小依次为15%、10%、5%、20%、25%，并且水解度先随底物浓度的增大而增大，在底物浓度为15%以后逐渐减小。其中底物浓度为15%、10%、5%的水解度较大，所以选择这3个条件做接下来的正交试验。

2.1.5酶解时间对胰蛋白酶水解度的影响。

在酶解温度40 ℃、底物浓度15%、pH 8.0、加酶量4 000 U/g、不同酶解时间下水解度的变化曲线见图5。由图5可得出，水解度在酶解时间为5 h时出现最高峰值，而其他几个时间段的水解度曲线较为平缓，变化较小。但其中酶解时间为3、4、5 h的水解较好，所以在接下来的正交试验中选用这3个条件。

2.2酶解条件的优化

在初步获得的单因素试验结果的基础上，从较优的水解条件中筛选出最好的水解条件，因此选择pH、水解温度、加酶量、水解时间和底物浓度5个因素，设计3个水平的正交试验，胰蛋白酶的正交试验结果见表2。

由表2数据可知，胰蛋白酶酶解鲤鱼鱼鳞的水解度最高

可达25.97%，证明胰蛋白酶对鲤鱼鱼鳞蛋白有着较好的水

解作用。原因可能在于，胰蛋白酶是一种消化酶，也是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前体，起活化作用[8]。胰蛋白酶还是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它也是不可缺少的工具。

表2中胰蛋白酶正交试验的水解度极差表明，影响胰蛋白酶酶解鲤鱼鱼鳞的因素大小顺序为底物浓度、时间、pH、加酶量、温度。正交试验较优组合为A3B2C1D3E1；直观分析得出水解能力较优条件是7号试验组（A3B2C1D3E3），即pH 84、酶解温度45 ℃、加酶量4 000 U/g、酶解时间3 h、底物浓度15%的条件下胰蛋白酶酶解鲤鱼鱼鳞的酶解能力较好。

表2中胰蛋白酶正交试验的羟自由基清除率极差表明，影响胰蛋白酶酶解鲤鱼鱼鳞的因素大小顺序为底物浓度、加酶量、pH、时间>温度。正交试验得到的较优组合A3B2C1D3E1；直观分析得出清除能力较优条件是7号试验组（A3B2C1D3E3），即pH 8.4、酶解温度45 ℃、加酶量4 000 U/g、酶解时间3 h、底物浓度15%的条件下胰蛋白酶酶解鲤鱼鱼鳞抗氧化能力较好。

综合考虑，最优组合为正交试验中的7号试验组。

3结论

通过参照水解度和羟自由基清除率在鲤鱼鱼鳞酶解过程中的变化，最后得出了较佳的鲤鱼鱼鳞酶解工艺条件条件即pH 8.4、酶解温度45 ℃、加酶量4 000 U/g、酶解时间3 h、底物浓度15%的条件下得到的鱼鳞肽抗氧化能力较好。

通过试验数据表明，胰蛋白酶在酶解鲤鱼鱼鳞的过程中，其水解度与羟自由基清除率是呈正相关的关系。

该试验以胰蛋白酶为例，对鱼鳞的水解度进行研究。试验过程中，鱼鳞酶解液有较大的腥味，并且酶解液成品为黄色透明的液体。研究表明，胰蛋白酶酶解鲤鱼鱼鳞后得到的短肽有一定的抗氧化活性。由于胰蛋白酶在酶解鲤鱼鱼鳞的过程中水解度不是很高，所以可能导致其对鱼鳞蛋白的回收率较低，从而影响了胰蛋白酶应用的可行性，所以在此方面仍需进一步研究。

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