IFN—γ对奶牛乳腺上皮细胞转分化的影响

孙俊若男 李海明 苏韵 屈利娜 党涵 杨磊

摘要 [目的]用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导奶牛乳腺上皮细胞-肌纤维母细胞转分化（EMT），以不同浓度的IFN-γ为阻断剂，探讨干扰素-γ（IFN-γ）对奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）表型重塑的作用。[方法]将原代培养的BMEC分为对照组、诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）、药物组（IFN-γ 20 ng/mL）及阻断组（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）。培养72 h后，观察α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、结缔组织生长因子（CTGF）和胶原I（COLⅠ α1）的mRNA相对表达量。[结果]诱导组α-SMA、CTGF和胶原I mRNA相对表达量显著增加（P<0.05）；药物组CTGF的mRNA相对表达量与对照组相比无显著差异（P>0.05），α-SMA和COLⅠ α1 mRNA相对表达量显著下降（P<0.05）；阻断组IFN-γ明显抑制了TGF-βl诱导的转分化。[结论]IFN-γ能够负性调控TGF-β1诱导的奶牛乳腺上皮细胞-肌纤维母细胞转分化（EMT），减少COLⅠ α1分泌。

关键词 TGF-β1；IFN-γ；奶牛乳腺上皮细胞；α-SMA；CTGF；胶原I

中图分类号 S823.9+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）04-0099-03

Effects of Interferon-γ（IFN-γ） on the Transdifferentiation of Mammary Epithelial Cells in Dairy Cows

SUN Junruonan， LI Hai-ming， SU Yun， YANG Lei* et al

（Orient Science & Technology College of Hunan Agricultural University， Changsha，Hunan 410128）

Abstract [Objective] Transforming growth factor-β1 （TGF-β1） was used to induce the transdifferentiation of mammary epithelial cells-myofibroblast cells of dairy cows. Taking different concentrations of IFN-γ as blocking agent， the effects of interferon-γ （IFN-γ） on the phenotypic remodeling of mammary epithelial cells of dairy cows were discussed. [Method] The mammary gland epithelial cells of primary culture were divided into control group，induced group （TGF-β1 10 ng/mL）， drug administration group （IFN-γ 20 ng/mL） and blocking groups（TGF-β1 10 ng/mL + IFN-γ 10，20，50，100 ng/mL） and cultured for 72 hours. mRNA expressions of α-SMA， CTGF and collagenⅠα1 were observed. [Result] mRNA relative expression quantity of a-SMA， CTGF and collagen I in induced group significantly increased （P<0.05）. Compared with control group， mRNA relative expression quantity of CTGF in drug administration group had no significant difference （P>0.05）， mRNA relative expression quantity of α - SMA and COL Ⅰ α1 significantly decreased （P<0.05）. IFN-γ obviously inhibited the transdifferentiation induced by TGF-β1 in blocking group. [Conclusion] IFN-γ can negatively regulate EMT induced by TGF-β1 and reduce the secretion of COL Ⅰ α1.

Key words TGF-β1；IFN-γ；Mammary epithelial cells of dairy cows；α-SMA；CTGF；Collagen I

IFN-γ是一種Thl型细胞因子，是由抗原、有丝分裂素等刺激，由活化的CD4+Thl、CD8+T细胞及自然杀伤细胞所分泌的一类可溶性糖蛋白，主要在单核细胞源树突状细胞和外周血单核细胞等抗原提呈细胞中表达。IFN-γ具有广泛的免疫调节作用，包括对巨噬细胞、NK细胞、B细胞的膜分子表达、活化和分化的影响。

近些年，在肝脏组织的纤维化研究中发现IFN-γ能够抑制肝脏星状细胞（HSC）增殖，对抗ECM的合成，从而抑制肝脏纤维化[1-3]。在特发性肺损伤（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的研究中发现，IFN-γ能够通过多种机制发挥抗肺纤维化作用。TGF-β的过量表达，是导致纤维化的主要诱因。在口腔黏膜瘢痕组织的研究中发现，IFN-γ在低剂量时能够促进成纤维细胞增殖，在高剂量时主要起抑制作用。然而，关于在乳腺纤维化的进程中IFN-γ的作用则鲜见报道。

细胞外基质（Extracellur matrix，ECM）的沉积、分解以及细胞凋亡等是组织器官发生纤维化的主要决定因素。ECM的合成与分泌主要由活化的成纤维细胞转化为肌纤维母细胞（Myofibroblast，MFB）完成，而α-SMA是MFB的标志性抗原[4-6]；CTGF是TGF-β1的重要下游因子，胶原蓄积是ECM沉积的重要表现。因此，α-SMA、CTGF及COLI α1 mRNA的表达能够在一定程度上反映细胞发生转分化及IFN-γ对转分化细胞表型重塑过程中起到的作用。笔者以TGF-β1为诱导剂，诱导奶牛乳腺上皮细胞-肌纤维母细胞转分化（EMT），以不同浓度的IFN-γ为阻断剂，探讨干扰素-γ（IFN-γ）对奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）表型重塑的作用，以期为奶牛乳腺组织重塑的机理研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

重组人TGF-β1和IFN-γ，均购自Peprotech公司；SYBR Primescipt real-time RT-PCR Kit、RNA iso plus、DNA Marker，购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养。奶牛乳腺上皮细胞由内蒙古农业大学病理学教研室提供，试验所用细胞为原代培养6～8代冻存细胞。复苏后待细胞长满培养瓶底壁80%时，用0.25%胰酶于37 ℃条件下消化4～8 min，以含10%FBS的培养液中止消化，重悬细胞液后进行细胞计数，按5×105个/mL的细胞浓度接种于6孔细胞培养板，待细胞长满底壁达90%融合时，加入含有0.1%FBS培养液处理24 h后，加入药物。

1.2.2 试验分组。试验分为空白对照组（无血清培养基）、诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）、药物组（IFN-γ 20 ng/mL）及阻断组（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）。每组设3个重复，分别加药物处理72 h。

1.2.3RT-PCR方法检测α-SMA、CTGF和COLIα1 mRNA的相对表达量。根据GenBank数据库中α-SMA 、CTGF、COLIα1和β-actin的序列，利用Primer 5.0软件设计引物（表1），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用反转录试剂中的EASY Dilution对cDNA（500 ng/μL）进行10倍稀释，做8个稀释倍数，然后将分别以各稀释倍数的cDNA 为模板进行RT-PCR检测，反应体系为：SYBR Primer EX TaqTMⅡ （2×）12.5 μL，PCR 正向引物（10 μmol/L）1 μL，PCR反向引物（10 μmol/L）1 μL，cDNA 2，ddH2O 8.5 μL；RT-PCR反應程序为：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环；绘制熔解曲线。选取线性较好的4～6个点制作标准曲线；以β-actin为内参，以等量相应的cDNA为模板，分别平行扩增α-SMA、CTGF和COLⅠ α1 。

1.2.4 数据处理。采用2-△△Ct法对试验数据进行处理，每个样品取2次测定的平均值，然后使用SAS 9.0统计软件进行统计与分析，各组间差异采用单因素方差分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 CTGF mRNA的相对表达量比较

从图1可以看出，与对照组相比，诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）CTGF mRNA相对表达量明显升高（P<0.05）；与对照组相比，药物组（IFN-γ 20 ng/mL）CTGF mRNA相对表达量受到抑制，但差异并不显著（P>0.05）；与诱导组相比，阻断组（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）CTGF mRNA的表达受到明显抑制，并呈剂量依赖。

2.2 α-SMA mRNA的相对表达量比较

从图2可以看出，与对照组相比，诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）α-SMA mRNA相对表达量明显升高（P<0.05）；与对照组相比，药物组（IFN-γ 20 ng/mL）α-SMA mRNA相对表达量受到明显抑制（P<0.05）；与诱导组相比，阻断组α-SMA mRNA的表达量受到明显抑制，并呈剂量依赖。

2.3 COLI α1 mRNA的相对表达量比较

从图3可以看出，与对照组相比，诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）COLI α1 mRNA相对表达量明显升高（P<0.05）；对照组与处理组（IFN-γ 20 ng/mL）BMEC COLI α1 mRNA相对表达量均较低，且差异不显著（P<0.05）；与诱导组相比，阻断组COLI α1 mRNA的相对表达量受到明显抑制，并呈剂量依赖。

3 讨论与结论

BMEC参与奶牛乳腺泌乳调控且在乳房炎发病过程中是病原损伤的主要细胞。乳腺纤维化是奶牛乳腺炎重要的病理表现，患病奶牛最终因泌乳功能下降或丧失被淘汰。目前，人类医学研究表明在多种组织器官纤维化进程中IFN-γ在不同程度上均能起到抑制纤维化的作用。在肝纤维化过程中，IFN-γ能够降低肝脏星状细胞（HSC）的活化和细胞外基质的沉积[7-8]；在肺脏纤维化研究中同样发现，IFN-γ能够改善肺纤维化的程度，缓解肺脏纤维化进程[9]。纤维化的发生与细胞外基质（ECM）的沉积密切相关，ECM的沉积的主要因素是间质细胞的超量表达和增生，而造成其超量表达的因素目前认为是由间质细胞原发性增殖和实质细胞发生转分化（EMT）引起。

该试验用TGF-β1诱导BMEC发生转分化，探讨在IFN-γ 作为药物逆转EMT的可能性。结果表明，诱导组（TGF-β1 10 ng/mL）BMEC α-SMA、COLⅠ α1及CTGF的mRNA相对表达量明显升高，说明诱导试验是成功的；药物

组（IFN-γ 20 ng/mL）

BMEC分泌α-SMA和COLⅠα1及TGF-β1下游因子CTGF具有较为明显的抑制；阻断组（TGF-β1 10 ng/mL+IFN-γ 10、20、50、100 ng/mL）诱导后BMEC α-SMA、COLⅠα1及CTGF的mRNA相对表达量均受到不同程度抑制，且随药物（IFN-γ）添加剂量的增大明显下降，具有剂量依赖性。这表明IFN-γ能够抑制肌纤维母细胞（MFB）标志因子α-SMA mRNA的表达，具有对BMEC表型重塑的促进作用；同时，间质细胞蓄积标志COLⅠα1[10] mRNA表达量的下降，表明IFN-γ能够阻止间质细胞蓄积及胶原的成熟，其作用途径可能是通过降低TGF-β1的活性，或是抑制TGF-β1下游因子CTGF的合成，或是通过抑制细胞转分化，减少肌纤维母细胞的数量间接抑制胶原的合成，或是直接抑制胶原的生成，其机理有待进一步验证。

综上所述，IFN-γ能够抑制TGF-β1诱导的EMT，还可抑制细胞外基质成分的产生，其机制可能与IFN-γ参与下调TGF-β1下游因子CTGF的表达有关。该试验结果可为奶牛乳腺纤维化进程的改善及乳腺纤维化的治疗提供新的思路和借鉴。

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