L-亮氨酸对猪流行性腹泻病毒感染仔猪血液生化指标和空肠免疫相关基因mRNA水平的影响

谢佳倩，周颖，张俊梅，徐海旺，李鹏，赵迪，王蕾，易丹，侯永清

（动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉430023）

L-亮氨酸对猪流行性腹泻病毒感染仔猪血液生化指标和空肠免疫相关基因mRNA水平的影响

谢佳倩，周颖，张俊梅，徐海旺，李鹏，赵迪*，王蕾，易丹，侯永清

（动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，武汉轻工大学动物科学与营养工程学院，湖北武汉430023）

本试验旨在研究L-亮氨酸（Leu）对猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染幼龄仔猪血液指标和空肠免疫相关基因mRNA表达量的影响，探索Leu对PEDV感染仔猪应激的缓解作用。选用30头体重相近的7日龄PEDV阴性仔猪，随机分为3个处理组：对照组、PEDV组和PEDV+Leu组，每个处理10个重复，每个重复一头猪。试验期10 d（7日龄～16日龄）。从第0天开始对PEDV+Leu组按2.8 g/kg体重饲喂Leu，而对照组和PEDV组均按4.1 g/kg体重饲喂L-丙氨酸。第7天早上对PEDV组和PEDV+Leu组采用口服的方式接种106.5TCID50的PEDV，同时对照组采用口服的方式接种等剂量的生理盐水，3 d后（16日龄）取血液和肠道样品。结果表明：与对照组相比，PEDV组仔猪血液中总胆红素（TBIL）水平、血小板分布宽度（PDW）及空肠黏膜CXCL11、REG3G mRNA表达量分别降低了20.92%、9.76%、56.00%、36.00%（P＜0.05），血液中白细胞（WBC）和淋巴细胞（LYM）数量、磷酸丝氨酸、酪氨酸和色氨酸浓度，及空肠粘膜GSTO2和HSPH1 mRNA水平分别提高了61.68%、27.66%、30.39%、50.54%、64.00%、75.00%、89.00%（P＜0.05）；与PEDV组相比，PEDV+Leu组仔猪血液中组氨酸、天冬酰胺、尿素氮（BUN）浓度分别升高了55.43%、32.58%、83.33%（P＜0.05），而二胺氧化酶（DAO）含量、单核细胞（MONO）、单核细胞比（Monocyte Ratio，MONOR）、磷酸丝氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、精氨酸、苏氨酸及空肠黏膜MX1和GSTO2 mRNA水平分别降低了28.80%、47.13%、43.87%、10.53%、42.12%、29.48%、29.82%、33.50%、32.11%、28.00%（P＜0.05）。因此，日粮中添加Leu提高了PEDV感染仔猪的免疫功能，缓解了PEDV感染仔猪的应激。

亮氨酸；仔猪；猪流行性腹泻病毒；血液生化指标；免疫

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒引起的一种高度接触性肠道传染病，是养猪生产中危害很大的疾病之一。PEDV的感染可引起猪肠绒毛损伤、吸收功能紊乱，出现严重腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。由于肠道受损严重，感染PEDV的猪生长性能显著降低，极大地影响了养猪生产效率（杨德全等，2013）。亮氨酸（Leu）是支链氨基酸（BCAA）之一，BCAA包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，哺乳动物自身不能合成，必须由日粮提供。BCAA是目前日粮必需氨基酸中数量最大的氨基酸，包括约35%肌肉蛋白的必需氨基酸和约40%哺乳动物的必需氨基酸。Leu的从头合成限于植物和微生物中，在哺乳动物体内不能从头合成。Leu可以起到氧化供能、促进蛋白质合成和提高免疫的作用（王彬等，2012）。研究表明，Leu对单纯疱疹病毒1型（HSV-1）导致的黏膜感染有保护作用，但对PEDV感染仔猪的作用效果鲜见报道。本试验以PEDV感染仔猪为对象，研究日粮中添加Leu是否对PEDV感染仔猪有保护作用，为其在防治猪流行性腹泻中的应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料与基础日粮L-Leu购置于Sigma公司（纯度为98.5%～101%）。PEDV为云南野毒株第14代（YN F14）。试验日粮为人工奶粉，其营养水平见表1。

表1 试验日粮（人工乳）营养水平

1.2试验动物及设计选用30头平均体重为（3.00±0.40）kg的7日龄PEDV阴性仔猪（杜洛克×长白×大白），随机分为3个处理组，每个处理组10个重复，每个重复一头猪。整个试验过程采用自由采食的方式饲喂人工奶粉（40～45℃温开水冲泡，人工奶粉和水按照1∶4的比例混匀）。PEDV+ Leu组按每头猪每千克体重一天饲喂2.8 g Leu，而对照组和PEDV组均饲喂4.1 g的L-丙氨酸（等氮对照）。试验期10 d。

1.3饲喂管理试验将猪舍、猪栏彻底打扫，熏蒸消毒。猪舍为全封闭式，屋顶以排气扇通风，塑料漏缝地板，舍温保持在22～25℃。动物每日饲喂5次（8∶30、11∶30、15∶00、18∶00、21∶00），每次每个处理饲喂量为2500 mL，平均每头猪每日饲喂量为250 g（根据NRC标准，每头猪每天250 g营养标准），每次喂食之前将料槽剩料倒掉，并消毒冲洗料盘。从第0天开始，将L-丙氨酸和Leu溶解在奶水中，饲喂仔猪；第7天早上对PEDV组和PEDV+Leu组采用口服的方式接种106.5TCID50的PEDV，对对照组采用口服的方式接种等剂量的生理盐水。攻毒后连续观察3 d，观察是否出现水样腹泻、呕吐症状。3 d后（16日龄），早上7点各组仔猪均灌服D-木糖（剂量为0.1 g/kg BW），1 h后前腔静脉采血，并用50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉仔猪，屠宰取肠道样本。

1.4样品采集与处理于试验第10天前腔静脉采血5 mL，室温下倾斜放置30 min后，3000 r/min离心10 min，分离血浆。收集空肠黏膜，置于-80℃冰箱冻存待测。

1.5测定指标及方法

1.5.1血浆生化指标的测定采用日立7020全自动生化分析仪测定血浆生化指标。

1.5.2血液常规指标的测定使用全自动五分类STKS血球分析仪进行检测。

1.5.3血浆DAO活性采用紫外比色法，用南京建成生物工程研究所试剂盒测定（王蕾等，2010）。1.5.4血液游离氨基酸的检测采用德国SYKAM S-433D型氨基酸分析仪检测血浆中游离氨基酸。

1.5.5空肠功能相关基因表达量的测定检测基因：Myxovirus Resistance 1（MX1）、热休克蛋白（HSPH1）、谷胱甘肽硫转移酶（GSTO2）、绒毛蛋白（Villin）、胰岛再生蛋白3 g（REG3G）。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）方法检测，总RNA的提取和cDNA的合成均采用试剂盒法，主要试剂为RNAiso Plus（Total RNA提取试剂）、Prime-ScriPt ®RT reagent Kit with cDNA Eraser（cDNA合成试剂盒）、SYBR®Premix Ex TaqTM（real-time PCR试剂盒），试剂盒均购于宝生生物工程（大连）有限公司。RT-PCR扩增的基因及内参RPL4的引物序列见表2。各基因PCR数据的结果分析参照Fu等（2010）的方法。

表2 检测基因对应的上下游引物序列

1.6统计分析试验结果用“平均值±标准差”表示。试验数据采用统计软件SPSS 17.0进行单因素方差（One-Way ANOVA）分析和Duncan’s多重比较检验，以P＜0.05为差异显著判断标准。

2结果与分析

2.1Leu对PEDV攻毒仔猪血液生化指标的影响由表3可知，与对照组相比，PEDV组仔猪血液中总胆红素（TBIL）水平显著降低了20.92%（P＜0.05）；与PEDV组相比，PEDV+Leu组仔猪的尿素氮（BUN）水平显著提高了83.33%（P＜0.05）。2.2Leu对PEDV攻毒仔猪血液常规指标的影响由表4可知，与对照组相比，PEDV组仔猪的白细胞（WBC）、淋巴细胞（LYM）数量分别提高了61.68%、27.66%（P＜0.05），但血小板分布宽度（PDW）显著下降了9.76%（P＜0.05）；与PEDV组相比，PEDV+Leu组仔猪的单核细胞（MONO）和单核细胞比（MONOR）分别降低了47.13%、 43.87%（P＜0.05）。

2.3Leu对PEDV攻毒仔猪血浆DAO含量的影响由表5可知，与PEDV组相比，PEDV+Leu组仔猪的DAO含量显著降低了28.80%（P＜0.05）。2.4Leu对PEDV攻毒仔猪血液游离氨基酸的影响由表6可知，与对照组相比，PEDV组仔猪血液的磷酸丝氨酸、酪氨酸、色氨酸浓度分别提高了30.39%、50.54%、64.00%（P＜0.05）；与PEDV组相比，PEDV+Leu组仔猪血液的磷酸丝氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、精氨酸、苏氨酸浓度分别降低了10.53%、42.12%、29.48%、29.82%、33.50%（P＜0.05），尿素、组氨酸、天冬酰胺浓度显著提高了83.33%、55.43%、32.58%（P＜0.05）。

表5 Leu对PEDV攻毒仔猪血浆DAO含量的影响

2.5Leu对PEDV攻毒仔猪空肠功能相关基因的影响由表7可知，与对照组相比，PEDV组仔猪空肠黏膜GSTO2、HSPH1 mRNA水平分别提高了75.00%、89.00%（P＜0.05），但CXCL11、REG3G mRNA水平显著降低了56.00%、36.00%（P＜0.05）。与PEDV组相比，PEDV+Leu组仔猪空肠MX1、GSTO2 mRNA水平显著降低了32.11%、28.00%（P＜0.05）。

3讨论

3.1Leu对攻毒仔猪血液生化指标的影响血液生化指标的改变组织细胞通透性和机体新陈代谢机能。血浆尿素氮是动物体内蛋白质代谢和日粮氨基酸平衡情况较为准确的反映指标，正常情况下，血浆尿素氮恒定在一定的范围内，并随蛋白质代谢程度的变化而变化，代谢平衡良好时尿素氮浓度下降（吴苗苗等，2013）。血清胆红素是体内衰老红细胞裂解释放出的血红蛋白而产生的，主要由血红蛋白在肝细胞内代谢转化，为天然内源性强抗氧化剂，具有抗脂质过氧化、清除自由基等作用，可减少氧化低密度脂蛋白形成，防止动脉粥样硬化（李慧华等，2016）。本试验结果表明，与对照组相比，PEDV组血液中TBIL水平显著降低，说明仔猪受PEDV感染后肠道氧化应激增加。与PEDV组相比，PEDV+Leu组血液中BUN水平显著提高，表明Leu可能影响了机体的蛋白质代谢，血液中的非蛋白氮升高。

表3 Leu对PEDV攻毒仔猪血液生化指标的影响

表4 Leu对PEDV攻毒仔猪血液常规指标的影响

表6 Leu对PEDV攻毒仔猪血浆中游离氨基酸的影响nmol/mL

表7 Leu对PEDV攻毒仔猪空肠免疫相关基因的影响

3.2Leu对攻毒仔猪血液常规指标的影响白细胞通常被称为免疫细胞，是机体防御系统的一个重要组成部分。它可通过吞噬和产生抗体等方式来抵御和消灭入侵的病原微生物。血小板是哺乳动物血液中的有形成分之一，在正常血液中有较恒定的数量。血小板的功能主要是促进止血和加速凝血，同时血小板还有维护毛细血管壁完整性的功能。有效的血小板质量和数量在机体正常止血过程中发挥着重要作用（张宇，2012）。研究表明，血液WBC、PDW值增高多见于细菌性炎症反应、严重呕吐、腹泻、大面积烧伤及各种原因导致的组织脱水等（何世山等，2003）。血液中的单核细胞和淋巴细胞，是身体重要的免疫细胞，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等重要作用。本试验发现PEDV显著提高仔猪血液中WBC、LYM。仔猪经口服PEDV后，发生了病毒性腹泻，引起仔猪血液WBC和LYM数量升高，造成仔猪炎性损伤。PEDV降低了仔猪血小板分布宽度，减弱了仔猪的止血和凝血功能，使得肠道黏膜损伤修复功能降低。单核细胞是机体防御系统的重要组成部分，能吞噬异物产生抗体，在机体损伤治愈、抵抗病原入侵和对疾病免疫方面发挥着重要作用。当机体受到外界异物刺激或发生炎症反应时，可引起血液中MONO和MONOR增加。本试验研究发现，人工乳中添加Leu有效降低了攻毒仔猪血液中MONO和MONOR，表明添加Leu可有效缓解PEDE感染仔猪的免疫应激，提高仔猪的免疫防御功能。

3.3Leu对攻毒仔猪血浆DAO含量的影响DAO是哺乳动物小肠黏膜上层绒毛中细胞内酶，其活性与小肠绒毛细胞的核酸和蛋白合成密切相关，当小肠肠黏膜发生损伤时，肠道黏膜通透性增加，DAO从小肠黏膜释放，引起血液DAO活性升高（胡泉舟等，2008）。因此，血液DAO的活性可间接反映肠黏膜的完整性及损伤程度，是监测肠道屏障功能的重要指标，腹泻严重程度与血液DAO活性呈显著相关（黎佳颖等，2015）。本试验结果显示，仔猪口服PEDV后血液中DAO含量有上升趋势，但差异不显著，而Leu可降低灌服PEDV的仔猪血浆DAO活性，提示Leu可能有利于缓解PEDV感染仔猪的肠道黏膜损伤。

3.4Leu对血液游离氨基酸的影响血浆游离氨基酸浓度在一定程度上可以反映动物体内氨基酸代谢状况。在日粮氨基酸可满足动物需要的前提下，氨基酸进一步平衡可降低血浆游离氨基酸浓度，这是因为氨基酸在体内不同组织器官的分流比例更趋合理而利用率得到提高；当日粮氨基酸不能满足动物需要时，血浆游离氨基酸浓度偏低（Malndof，1988）。王彬等(2012）研究报道，添加0.55%亮氨酸可以显著提高断奶仔猪心脏、小肠后段、肾脏、肝脏、胰脏、脾脏和胃的蛋白质合成速率。本试验中，与对照组相比，PEDV组仔猪血液中的磷酸丝氨酸、酪氨酸、色氨酸浓度显著提高，而Leu显著降低了磷酸丝氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、精氨酸、苏氨酸浓度，提高了尿素、组氨酸、天冬酰胺浓度。其中，苏氨酸、异亮氨酸为必需氨基酸，这说明添加Leu促进了动物体内氨基酸之间的平衡，提高了氨基酸利用率。Eggum（1970）研究报道，血液BUN含量直接关系到蛋白质饲料的质量和在体内的氨基酸利用率。本试验结果显示，PEDV+ Leu组血液中尿素含量显著提高，这与血浆生化指标结果相符，说明Leu可能影响了机体肾脏功能或蛋白质代谢，具体作用机制有待进一步研究。

3.5Leu对攻毒仔猪空肠功能相关基因的影响Mx基因是一类抗病毒基因，主要有Mx1、Mx2两类，能通过其蛋白质或mRNA表达来反映干扰素的生物活性，其中Mx1位于细胞核内，能有针对性抑制A型流感病毒和托高士流感病毒（何丹妮等，2012）。热休克蛋白（HSP）是一类非常保守的蛋白质分子家族，HSPH1是其中的一员，它能在高热、氧化应激等应激状态下，提高细胞对损害的耐受程度（Hong等，2014）。谷胱甘肽硫转移酶（GSTs）在神经组织中的表达增加可对抗氧化应激，GSTO2是GSTs的一个亚型（梁冰等，2006）。胰岛再生蛋白3 g（REG3G），为胰腺炎相关蛋白，是一种C凝聚素蛋白，急性胰腺炎时由腺泡细胞分泌，可以调控免疫应激、细胞识别和黏附、抑制细胞凋亡等多个生物过程（VAN，2013）。本试验中，PEDV感染降低了仔猪空肠REG3G mRNA表达量，但提高了肠道HSPH1，表明PEDV诱导了仔猪肠道应激。而Leu降低了仔猪空肠MX1、GSTO2基因表达量，表明Leu可能通过调控抗病毒基因和抗氧化基因的表达来影响仔猪的抗病毒能力。

4结论

日粮中添加Leu提高了仔猪的免疫功能，对PEDV感染仔猪的应激具有一定缓解作用。

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This experiment was conducted to study the effects of leucine（Leu）on blood biochemical parameters and immune-related genes in the jejunum mucosa of piglets infected by PEDV，thereby to determine whether Leu can relieve the stress on piglets caused by PEDV.A total of 30 7-day piglets of similar weight without PEDV were selected and randomly divided into three treatment groups：control group，PEDV group，PEDV+Leu group.Each group had 10 replicates with 1 piglet each.The experiment lasted for 10 days.Piglets in PEDV+Leu group were fed with Leu at the dosage of 2.8 g per kilogram of body weight per day，whereas those in control and PEDV groups were fed with L-alanine at the dosage of 4.1 g per kilogram of body weight per day.On the morning of the 7th day，piglets in PEDV and PEDV+Leu group were vaccinated orally with 106.5TCID50 PEDV，while those in the control group treated with same dose of saline solution.The results showed that：compared with control group，the number of white blood cells（WBC）and lymphocytes（LYM），the concentration of phosphoserine，tyrosine，tryptophan in blood，and the expressions of GSTO2 and HSPH1 gene in jejunum mucosa were significantly improved by 61.68%，27.66%，30.39%，50.54%，64.00%，75.00%，89.00%respectively（P＜0.05），but the TBIL，PDW in the blood，and the expressions of GSTO2 and HSPH1 gene in jejunum mucosa in PEDV group were decreased by 20.92%，9.76%，56.00%，36.00%（P＜0.05）.Compared with PEDV group，the expressions of GSTO2 and MX1 gene in jejunum，mononuclear cell（MONO），MONOR，phosphoserine，glutamic acid，isoleucine，arginine，threonine，and DAO in blood were significantly decreased by 28.00%，32.11%，47.13%，43.87%，10.53%，42.12%，29.48%，29.82%，33.50%，28.80%（P＜0.05），while histidine，urea，and asparagine were significantly increased by 55.43%，83.33%，32.58%（P＜0.05）.In conclusion，Leu may improve the immune function of piglets and partially mitigate the stress induced by PEDV infection.

leucine；piglets；porcine epidemic diarrhea vinus；blood biochemical parameters；immune

S816.7

A

1004-3314（2017）12-0027-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171208

国家自然科学基金（31572416）；武汉轻工大学科研项目（2016J08）

*通讯作者