卵巢癌中E2通过ERα降低顺铂敏感性的研究

李文媛，牛强，宋丽华

(1.长治医学院 药学系，山西 长治 046000； 2.中国人民解放军火箭军总医院，北京 100032)

·论 著·

卵巢癌中E2通过ERα降低顺铂敏感性的研究

李文媛1，牛强2，宋丽华1

(1.长治医学院 药学系，山西 长治 046000； 2.中国人民解放军火箭军总医院，北京 100032)

卵巢癌是最致命的妇科癌症，约70%的患者被诊断出时已是晚期。目前卵巢癌的标准治疗是手术，然后是基于铂类的化疗[1]；但其因对铂的敏感性降低而容易复发[2]。因此了解卵巢癌如何变得铂耐受并开发针对铂抗性卵巢癌的分子靶向治疗非常重要。

细胞存活和凋亡之间的平衡可以评价肿瘤细胞对化学治疗剂的敏感性。我们发现Akt和ERK通路在卵巢癌细胞中被顺铂激活，并且参与卵巢癌细胞对顺铂的耐受性调节。在卵巢癌细胞中，ER拮抗剂氟维司群(ICI)可以改善顺铂对卵巢癌细胞的功效。然而，尚不知道ERα激活是否会诱导卵巢癌的铂抗性。在本研究中，我们检测了顺铂是否通过激活ERK或Akt通路诱导ERα的磷酸化，同时还研究了E2介导的ERα激活对顺铂敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

1.2 细胞培养

1.3 siRNA转染

1.4 细胞增殖、活性及凋亡实验

1.5 蛋白质印迹

1.6 荧光素酶测定

使用荧光素酶试剂盒检测。去掉细胞培养基，使用PBS洗3次。加入裂解液，充分裂解后10 000×g离心5 min，取上清用于测定。融解萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温。按照每个样品需100 μl的量，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照1∶100加入海肾萤光素酶检测底物(稀释100倍)配制成海肾萤光素酶检测工作液。每个样品测定时取样品100 μl。加入100 μl萤火虫萤光素酶检测试剂，用枪打匀后测定相对光单位(relative light unit，RLU)。

1.7 统计学处理

所有数据均采用SPSS 19.0进行统计分析。组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，LSD用于进一步的两两比较。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 下调ERα可抑制E2诱导的卵巢癌细胞增殖

2.2 顺铂可诱导ERα在丝氨酸118位点处的磷酸化及其转录活性

图2 顺铂可诱导ERα的磷酸化及转录活性 A.顺铂诱导ERα在丝氨酸118位点处的磷酸化；B.分别为0.1 μmol·L-1E2、10 μmol·L-1ICI和100 μmol·L-1顺铂的不同组合对ERα转录活性的影响；C.分别为100 μmol·L-1顺铂、10 μmol·L-1LY294002和10μmol·L-1PD98059的不同组合对ERα、AKT和ERK磷酸化的影响；aP<0.05，bP<0.005

2.3 E2通过ERα拮抗顺铂诱导的细胞毒性

图3 E2通过ERα拮抗顺铂诱导的细胞毒性 A、B.分别为0.1 μmol·L-1E2、10 μmol·L-1ICI和100 μmol·L-1顺铂的不同组合对卵巢癌细胞活性的影响；C.0.1 μmol·L-1E2、10 μmol·L-1ICI和100 μmol·L-1顺铂不同组合的IC50检测；D、E.ERα被下调后，0.1 μmol·L-1E2和100 μmol·L-1顺铂的不同组合对细胞活性的影响；aP<0.05，bP<0.01

3 讨 论

本研究结果与其他报道一致，都表明E2通过对ERK和Akt的调节进而促进ERα表达，从而诱导细胞增殖，但并无相关报道说明顺铂在卵巢癌细胞中可激活ERα。本研究发现顺铂可诱导ERα在丝氨酸118处的磷酸化，PD98059(ERK抑制剂)而不是LY294002(PI3K/Akt抑制剂)降低顺铂诱导的ERα活化。这些研究结果表明ERK可能是顺铂诱导卵巢癌细胞ERα激活的主要机制。

激素ERα靶向治疗可预防ERα阳性乳腺癌复发并降低死亡率，然而，卵巢癌中对ERα靶向治疗的反应有限，他莫昔芬(一种选择性雌激素受体拮抗剂)对复发性卵巢癌的临床反应率为48%[7]。此外，在卵巢癌的治疗中，与一线化疗药物和他莫昔芬联合治疗并未提高药物的细胞毒性[8]。然而，以前的临床研究并没有观察ERα的表达，需要进一步的研究来评价ERα表达情况与他莫昔芬疗效之间的关联。ICI是一种新型的雌激素受体拮抗剂，其可竞争性结合ER，结合能力比他莫昔芬大约100倍，这种结合可诱导ER的快速降解，导致E2诱导的转录活性的抑制[9- 10]。在ERα阳性复发性卵巢癌中，ICI的Ⅱ期研究表明，几乎一半的患者具有临床疗效，并且没有发展成2、3或4期肿瘤，ICI在复发性卵巢癌患者中具有良好的耐受性和有效性[11- 12]。在本研究中，ICI虽不能增加顺铂的疗效，但可抑制E2诱导对顺铂细胞毒性的保护作用，因此，ICI可能用于在E2高表达的卵巢癌中与顺铂联合治疗。

综上，顺铂激活的ERα可被ERK调节，同时，E2诱导的ERα激活可降低顺铂的细胞毒性，这种降低是通过抑制卵巢癌细胞的凋亡实现的。我们还发现，ERα表达的下调可通过抑制E2诱发的对顺铂的抗性的拮抗作用，ERα可能是一个潜在的治疗靶标，并可应用于铂抗性卵巢癌的治疗。此外，以前的临床研究表明ERα靶向治疗在卵巢癌中效果有限。因此，在ERα靶向治疗中，新型的ER阻断剂ICI用于卵巢癌治疗新策略十分重要，并且需要选择ERα高表达的患者，这对卵巢癌患者的治疗十分有益。

[3] CHAN K K,LEUNG T H,CHAN D W,et al.Targeting estrogen receptor subtypes (ERα and ERβ) with selective ER modulators in ovarian cancer[J].J Endocrinol，2014,221(2):

E2 reduces the sensitivity of cisplatin in ovarian cancer

(1.DepartmentofPharmacy,GraduateSchoolofChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,China；2.GeneralHospitalofChinesePeople’sLiberationArmyRocketForce，Beijing100032,China)

R737.31

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