银杏叶提取物对肝纤维化模型大鼠的影响及抗肝纤维化机制的研究

尚瑞 吴军 郑雪皎

·论著·

银杏叶提取物对肝纤维化模型大鼠的影响及抗肝纤维化机制的研究

尚瑞 吴军 郑雪皎

目的 探讨银杏叶提取物(GBE)对肝纤维化模型大鼠的影响及抗肝纤维化机制。方法 SD大鼠60只随机分为正常组(n=12)和模型组(n=48)，模型组大鼠又分为4个亚组：模型对照组、GBE低、中、高剂量组(n=12)，GBE低、中、高剂量组每天分别灌胃给予GBE 50 mg/kg、100 mg/kg及200 mg/kg,正常组和模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液，连续2个月(1次/d)。给药结束后腹主动脉取血，分离血清，试剂盒检测肝功能指标(ALT、AST、MDA、SOD、白蛋白、球蛋白及白/球)，放免法检测肝纤维化指标(HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN)，大鼠脱颈椎处死后立即取右叶部分肝组织，液氮速冻后于-80℃保存，RT-PCR检测肝组织 TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型胶原mRNA的表达水平。结果 与模型对照组比较，GBE中、高剂量组AST、ALT、球蛋白及肝纤维化各项指标显著降低，TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型胶原mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，白蛋白水平、白/球值显著升高(P<0.05)，MDA水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 GBE能显著改善肝纤维化大鼠的肝功能指标，肝纤维化指标，其机制可能是通过降低TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型胶原mRNA表达水平来实现的。

银杏叶提取物；肝纤维化；RT-PCR；TGF-β1；TIMP1；Ⅰ型胶原

肝纤维化是各种慢性病发展过程中，肝内胶原增生与分解失调导致过多胶原异常沉积于肝的过程，常由于细胞坏死或炎症刺激产生[1，2]。其发展结果为肝硬化的形成，随着国内外学者对肝纤维化的重视，中药治疗肝纤维化的作用也有了突破性进展，有研究发现，银杏叶提取物(GBE)含有抗组织纤维病变的成分[3-5]。因此,本研究通过观察GBE对肝纤维化大鼠各项相关指标的观察,探讨银杏提取物对肝纤维化模型大鼠的影响及抗肝纤维化机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级大鼠60只，雄性，体重180～220 g(湖北医学实验动物中心提供)，许可证号：SCXK(鄂)2014-0095。

1.2 药物与试剂 银杏叶提取物(GBE,购于武汉诺见生物技术有限公司,批号:060092)，其中黄酮苷24.6%，银杏内酯6.11%;CCL4(郑州化学试剂厂,批号:20160325);丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司，批号分别为20160520、20160621、20160515、20160605;总蛋白(批号:161523),白蛋白(批号:160106),均购自广州威佳科技有限公司;透明质酸(HA，批号：20160315)、PC-Ⅲ(Ⅲ型前胶原，批号：20160712)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ，批号：20160605)、层粘连蛋白(LN，批号：20160421)试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司；橄榄油(上海化学试剂厂，批号：974623)；总RNA提取试剂盒(Trizol,批号:160525)、逆转录试剂盒(MmlV,批号:RR053A)，及PCR反应试剂盒(批号:20150620)均购自大连宝生物工程有限公司,TGF-β及、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP1)、Ⅰ型胶原mRNA引物均由大连宝生物工程有限公司设计。

1.3 仪器 KDC-220HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司);多功能酶标仪(美国铂金埃尔默有限公司);Forma-85℃冰箱(美国Thermo公司);Stepone Plus荧光定量PCR仪(美国ABI公司);普通PCR仪(美国PE公司)。

1.4 方法

1.4.1 肝纤维化大鼠模型建立[6]:60只SD大鼠随机分为正常组(n=12)和模型组(n=48)，模型组大鼠每周3次皮下注射40%CCL4橄榄油溶液(5 ml/kg),连续造模6周,正常组给予等量橄榄油。

1.4.2 分组及给药:模型组48只大鼠分为模型对照组(n=12)，GBE低(n=12)、中(n=12)、高(n=12)剂量组，GBE低、中、高剂量组分别灌胃给予GBE 50 mg/kg、100 mg/kg及200 mg/kg,模型对照组给予等量的0.9%氯化钠溶液,连续给药2个月(1次/d)。给药结束后水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，脱颈椎处死后，立即取右叶部分肝组织，于液氮中速冻后保存于-80℃冰箱待用。

1.4.3 样品处理及指标检测:①肝功能检测：腹主动脉取血，4℃,3 000 r/min离心,分离上层血清检测:a.肝损害程度指标AST、ALT;b.肝细胞蛋白合成功能相关指标：白蛋白及总蛋白并计算白球蛋白比;c.抗氧化相关指标:MDA及SOD，所有操作均严格按照试剂盒说明进行。②肝纤维化指标检测：放免法检测血清HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN水平，所有操作均严格按照试剂盒说明进行。③RT-PCR测定肝组织 TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型胶原mRNA的表达水平：将-80℃冰箱保存的肝组织按试剂盒说明书进行匀浆,抽提RNA,PCR反应条件为TGF-β1:起始预变性 94℃ 5 min,开始循环 94℃ 30 s,57℃30 s,72℃ 45 s,循环32次,72℃延伸 10 min,4℃保存。TIM P1和Ⅰ型胶原于95℃预变性3 min,开始循环:95℃30 s,57℃30 s,4℃保存待测。见表1。

表1 荧光定量PCR TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型胶原mRNA引物反应序列

2 结果

2.1 行为学观察 造模后，模型组大鼠状态萎靡，活动减少，静卧，毛色暗淡，烦躁，饮水量及食量减少，处死取肝脏发现肝脏粗糙晦暗，触摸有硬感，GBE低、中、高剂量组症状较轻。

2.2 肝功能相关指标检测

2.2.1 肝损害程度指标ALT及AST水平变化:与正常组比较,模型对照组血清ALT及AST水平显著升高(P<0.05)。与模型对照组比较，GBE中剂量及高剂量组ALT水平显著高于模型对照组(P<0.01)；GBE低、中及高剂量组AST水平显著高于模型对照组(P<0.05)。见表2。

组别ALTAST正常组22.26±5.3739.95±6.63模型对照组80.19±9.22*82.45±12.36*GBE低剂量组71.16±6.3167.39±7.11#GBE中剂量组56.38±5.59#51.17±4.92#GBE高剂量组31.19±4.17#43.22±3.69#

注：与正常组比较，*P<0.05;与模型对照组比较,#P<0.05

2.2.2 肝细胞蛋白合成功能相关指标变化:与正常组比较,模型对照组血清白蛋白水平及白/球蛋白比值显著降低(P<0.05)；球蛋白水平显著升高(P<0.05)。与模型对照组比较，GBE中剂量及高剂量组白蛋白水平及白/球蛋白比值显著高于模型对照组(P<0.05)；球蛋白水平显著高于模型对照组(P<0.05),球蛋白水平明显低于模型对照组(P<0.05)。见表3。

表3 血清白蛋白、球蛋白水平及白/球值的变化 ±s

注：与正常组比较，*P<0.05;与模型对照组比较,#P<0.05

2.2.3 抗氧化相关指标MDA和SOD水平变化:与正常组比较,模型对照组血清SOD水平显著升高(P<0.01)，MDA水平变化差异无统计学意义(P>0.05)。与模型对照组比较，GBE低剂量、中剂量及高剂量组SOD水平显著低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05),MDA水平变化差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

组别MDA(μmol/ml)SOD(nmol/ml)正常组93.63±3.191.53±0.46模型对照组94.11±2.473.52±1.01*GBE低剂量组92.94±5.161.96±0.33#GBE中剂量组93.87±4.132.21±0.47#GBE高剂量组94.70±3.172.96±0.39#

注：与正常组比较，*P<0.05;与模型对照组比较,#P<0.05

2.2.4 肝纤维化指标检测情况:与正常组比较,模型对照组血清HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN水平显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较，GBE低剂量、中剂量及高剂量组血清PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN水平显著低于模型对照组(P<0.05)；GBE中剂量及高剂量组HA水平显著低于模型对照组(P<0.05)。见表5。

组别HA(ng/dl)PC-Ⅲ(ng/dl)C-Ⅳ(U/ml)LN(ng/dl)正常组151.37±33.6776.09±14.1858.13±9.6335.07±6.62模型对照组433.82±76.10*229.11±37.12*101.24±13.67*105.47±15.54*GBE低剂量组371.65±67.43186.13±29.62#87.10±12.17#81.06±11.63#GBE中剂量组302.14±61.42#142.23±31.17#71.06±10.19#63.17±12.17#GBE高剂量组221.17±49.96#106.52±26.31#62.54±13.17#47.16±5.97#

注：与正常组比较，*P<0.05;与模型对照组比较,#P<0.05

2.2.5 肝组织 TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型胶原mRNA表达水平检测结果:与正常组比较,模型对照组肝组织TGF-β1,TIMP1及I型胶原mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较，GBE低剂量、中剂量及高剂量组肝组织TGF-β1、TIMP1及Ⅰ型胶原mRNA表达水平显著低于模型对照组(P<0.05)。见图1,表6。

图1 肝组织 TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型胶原 m RNA 的表达水平变化

组别TGF-β1TIMP1Ⅰ型胶原正常组0.51±0.050.92±0.090.4±0.12模型对照组0.53±0.10*3.91±0.25*0.75±0.22*GBE低剂量组0.54±0.39#2.41±0.80#0.23±0.07#GBE中剂量组0.52±0.23#1.95±0.21#0.62±0.11#GBE高剂量组0.51±0.01#1.2±0.02#0.31±0.09#

注：与正常组比较，*P<0.05;与模型对照组比较,#P<0.05

3 讨论

肝纤维化是各种慢性病发展过程中，肝内胶原增生与分解失调导致过多胶原异常沉积于肝的过程，常由于细胞坏死或炎症刺激产生。随着国内外对肝纤维化的重视，氧自由基及脂质过氧化已成为肝纤维化研究的重点课题。银杏叶在临床上用药已久，银杏叶提取物的指标性成分黄酮及银杏内酯具有清除氧自由基等作用[7,8]。因此,本研究通过观察GBE对肝纤维化大鼠各项相关指标的观察,探讨GBE对肝纤维化模型大鼠的影响及抗肝纤维化机制。

血清ALT和AST是肝损伤的主要标志。当发生肝损害时，ALT和AST活性显著升高，球蛋白升高,白蛋白及白/球比值下降,且血清ALT和AST水平与肝损伤程度呈正相关。本研究结果显示，GBE干预后，肝纤维化模型大鼠血清ALT水平、白蛋白水平及白/球蛋白比值显著高于模型对照组(P<0.05)；GBE低剂量,中剂量及高剂量组AST及球蛋白水平。提示银杏叶提取物可以减轻肝损伤。

脂氢过氧化物的产物丙二醛(MDA)及过氧化物歧酶是检测脂质过氧化的主要标志[9-11]，其血清水平可间接反应机体受自由基损伤程度，本研究结果显示GBE低剂量、中剂量及高剂量组SOD水平显著低于模型对照组(P<0.05),MDA水平无明显变化。提示银杏叶提取物减轻肝损伤与SOD有关。

肝纤维化是肝内胶原增生与分解失调导致过多胶原异常沉积于肝的过程。蛋白多糖、胶原蛋白及粘连蛋白是肝纤维化的主要参与者。PC-Ⅲ(Ⅲ型胶原的前体),HA(透明质酸)及LN(层粘连蛋白)是这三种参与者的代表，肝细胞损伤的严重程度与这三种成分在体内的沉积成正相关，血清中PC-Ⅲ、HA及LN水平可以反映它们在肝部的沉积情况，可以反映肝纤维化的程度[12,13]。此外，Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)是组成基底膜的主要成分，是最先增生的胶原，且转换率快，与肝纤维化程度密切相关，临床上检测这些项目指标可以基本上判定肝纤维化的程度[14,15]。本研究结果显示，GBE低剂量、中剂量及高剂量组血清PC-Ⅲ、C-Ⅳ及LN水平显著低于模型对照组(P<0.05)；GBE中剂量及高剂量组HA水平显著低于模型对照组(P<0.05)。提示GBE可明显减轻肝纤维化程度。

研究显示，肝纤维化时，大量细胞因子被激活后释放，激活杆星状细胞(HSC)产生胶原等胞外基质,导致胞外基质过度沉积，细胞因子在肝纤维化中的作用逐渐凸显，转化生长因子β1(TGF-β1)被证明是发生肝纤维化的关键，MMPs是胞外基质降解所需的主要酶,它主要受TIMPs所调控,TIMPs表达水平升高可直接抑制MMPs的合成,从而消除胞外基质的沉积[16]。因此，降低 MMPs 的表达水平,增加TIMP1的表达水平已成为减少肝纤维化发生的新课程。本实验研究显示，GBE低剂量、中剂量及高剂量组肝组织TGF-β1、TIMP1及Ⅰ型胶原mRNA表达水平显著低于模型对照组(P<0.05)，提示GBE抗肝纤维化作用可能是通过MMPs/TIMP1/TGF-β1通路来实现的。

综上所述，GBE能显著改善肝纤维化大鼠的肝功能指标，肝纤维化指标，其机制可能是通过降低TGF-β1、TIMP1,Ⅰ型胶原mRNA表达水平来实现。

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Effects of extract of ginkgo biloba leaf on liver fibrosis of rats and its action mechanism against liver fibrosis

SHANGRui*,WUJun*,ZHENGXuejiao.

DepartmentofDigestiveSystemDiseases,People’sHospitalAffiliatedtoHubeiMedicineCollege,Hubei,Shiyan442000,China

Objective To investigate the effects of extract of ginkgo biloba leaf (GBE) on liver fibrosis of rats, and to explore its action mechanism against liver fibrosis.Methods Sixty SD rats were randomly divided into normal control group (n=12) and model group (n=48).The rats in model group were redivided into four subgroups:model control group, low-dose GBE group,median-dose GBE group and high-dose GBE group,with 12 rats in each group. The rats in three GBE groups were given GBE 50mg/kg,100mg/kg,200mg/kg, respectively by gavage,however,the rats in normal control group and model control group were given equal volume of 0.9% sodium chloride solution,once a day for 2 months.After administration, the serum levels of ALT,AST,MDA,SOD,albumin,globulin (albumin/globulin) were detected by Kit.The liver fibrosis indexes including HA,PC-Ⅲ,C-Ⅳ and LN were measured by radioimmunoassay.After the rats were sacrificed,the right lobe of the liver tissue was taken out,and the expressin levels of TGF-β1,TIMP1,type Ⅰ collagen mRNA were detected by RT-PCR.Results As compared with those in model control group,the serum levels of AST,ALT,globulin and hepatic fibrosis indexes in median-dose GBE group and high-dose GBE group were significantly decreased,and the expression levels of TGF-β1,TIMP1 and type Ⅰ collagen mRNA were significantly decreased too (P<0.05).However the levels of albumin and the ratio of albumin/globulus were significantly increased (P<0.05),but the levels of MDA were not changed obviously.Conclusion The extract of ginkgo biloba leaf can significantly improve liver function indexes and hepatic fibrosis indexes of rats with liver fibrosis,and its action may be completed by reducing the expression level of TGF-β1,TIMP1 and type Ⅰ collagen mRNA.

extract of ginkgo biloba leaf;hepatic fibrosis; RT-PCR; TGF-β1; TIMP1; type Ⅰ collagen

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.13.002

442000 湖北省十堰市，湖北医药学院附属人民医院消化内科(尚瑞、吴军)，药学部(郑雪皎)

吴军，442000 湖北省十堰市，湖北医药学院附属人民医院消化内科；

E-mail：jun1839@163.com

R 349.31

A

1002-7386(2017)13-1930-04

2016-12-26)