CTNNB1基因沉默后卵巢癌细胞生长的研究

陈方旭 刘海艳(通讯作者) 刘建伟

121001锦州医科大学附属第一医院

CTNNB1基因沉默后卵巢癌细胞生长的研究

陈方旭 刘海艳(通讯作者) 刘建伟

121001锦州医科大学附属第一医院

目的：探讨CTNNB1沉默对卵巢癌细胞增殖的作用。方法：用人类卵巢癌SKOV3细胞于体外培养，随机分为空白对照组、阴性对照组和CTN实验组，然后转染入靶向CTNNB1的shRNA载体质粒。通过Westernblot及MMT的方法检测CTNNB1的蛋白表达及细胞的活力。结果：以CTNNB1为靶向的shRNA能下调CTNNB1蛋白质在细胞中的表达(P＜0.05)；转染CTNNB1的shRNA后，CTN组的细胞生长活性与增殖受到了明显的抑制(P＜0.05)。结论：CTNNB1基因的表达下调可抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖。

卵巢癌；CTNNB1；ShRNA

卵巢癌在妇科肿瘤中发病率占第3位，但其死亡率位居首位，70%以上的患者首次发现时已属晚期，预后不良[1]。近年来研究表明，Wnt/β-catenin信号通路的变异可能与肿瘤的发生有关，并且可诱导肿瘤免疫耐受[2]。CTNNB1是β-catenin的编码基因，前期研究提示CTNNB1蛋白在卵巢癌组织中异常高表达，并且可能与淋巴转移相关[3]。本研究旨在进一步探讨CTNNB1在卵巢癌细胞增殖中的作用。

资料与方法

实验材料：①ShRNA的设计和质粒构建：CTNNB1siRNA序列：正义链5'-AACAGTCTTACCTGGACTCTG-3'，以人和小鼠的基因无同源性的序列作为阴性对照，并整合到含有RNA聚合酶IIIU6增强子的质粒。将含靶向CTNNB1序列的质粒命名为p-CTN，对照组的质粒则为p-NEG。②细胞及培养：人卵巢上皮浆液性癌细胞系SKOV3置于完全培养基(RPMI1640培养基加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，于37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱无菌培养。观察细胞生长状态，每2～3 d传1代。选取对数生长期细胞。③主要试剂：LipofectamineTM2000；cDNA合成试剂盒，CTNNB1抗体，化学发光试剂盒ECLTestKit，甲基噻唑基四唑MMT，酶联免疫吸附检测仪，PI，流式细胞仪。

质粒转染：利用Lipofectamine TM2000转染shRNA质粒。选取对数生长细胞随机分3组：空白对照组、阴性对照组和CTN实验组。阴性对照组转染p-NEG质粒；CTN组转染p-CTN质粒；于转染24 h时，更换培养基为正常培养基(含10%FBS和抗生素的)，培养72 h。

蛋白质印记法：转染48 h后获取细胞。超声裂碎细胞，测定每次裂解的蛋白质产物浓度(考马斯亮蓝G-250染色法)。加入缓冲液，煮沸3 min后做电泳。电泳前，以1∶1的比例混合蛋白质样品与2×加样缓冲液。将印迹转移至硝化纤维膜，先用CTNNB1抗体孵育，然后采用二抗孵育。以β-catenin作为内参，检测蛋白表达量(化学发光试剂盒)。

MTT：转染后的细胞以1×104/mL接种96孔板，贴壁生长24 h。采用浓度5 mg/mL PBS溶解甲基噻唑基四唑MTT，然后进行过滤。向每孔中加入储存液10 μL。于37℃孵育4 h，然后加MTT，用100 μL DMSO替换培养基，室温静置30 min。采用酶联免疫吸附检测仪(570 nm)检测结果。分别在转染后12 h、24 h、48 h、72 h时测定每组结果。细胞存活率=A1/A2×100%(A1为实验组吸收率，A2为空白对照组吸收率)。纵坐标为细胞存活率，横坐标为时间，绘制生长曲线。

统计学方法：采用SPSS 18统计软件进行数据处理，定量资料的描述采用(±s)表示，组间比较采用t检验，检验水准为α=0.05。

结 果

靶向CTNNB1 shRNA抑制目的基因的蛋白表达：通过Westernblot方法检测发现，β-catenin蛋白表达分别为：空白对照组(0.87±0.01)、阴性对照组(0.85±0.02)、CTN实验组(0.53±0.02)。统计结果显示：CTN实验组卵巢癌细胞株的CTNNB1蛋白表达下调率约为36.86%，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

转染靶向CTNNB1 shRNA后卵巢癌细胞增殖被抑制：在MTT实验中发现，在转染靶向CTNNB1 shRNA后，明显抑制了细胞的增殖。转染24 h后，阴性对照与空白对照组的细胞存活率分别为96.3%和95.4%，显著高于CTN组(63.5%)。于转染72 h时检测CTN组的细胞存活率47.7%，而阴性对照与空白对照组分别为87.2%和86.1%。于转染后的24 h、72 h时CTN组的细胞生长活性与增殖均显著低于空白对照组(P＜0.05)。

讨 论

肿瘤的发生及进展的过程极其复杂，目前研究表明wnt/CTNNB1信号通路参与该过程。而近几年对β-catenin与恶性肿瘤的关系的新认识把有关CTNNB1的研究推向新的阶段。wnt信号通路在胚胎时期有调控细胞生长及组织分化的作用，在成体组织中有调节干细胞及组织动态平衡的作用[4]。Wnt信号通路的经典调节方式之一便是通过CTNNB1蛋白去磷酸化、稳态及转运到胞核内发挥作用[5]。转运入核后的CTNNB1蛋白与T细胞转录因子(TCF)共同调节Wnt信号通路下游靶基因可能引起细胞癌变[6]。研究证明，乳腺癌的上皮间质转化过程中CTNNB1蛋白的转位是必不可少的[7]。越来越多的研究提示，CTNNB1编码蛋白在肿瘤浸润、转移中可能起着重要的作用[8]。并且近来多项体外、体内研究表明，靶向CTNNB1蛋白可在肿瘤早期阶段抑制其发展、转移[9]。

本实验通过shRNA干扰技术、Westernblot、MMT方法，进一步证明了在卵巢癌细胞中抑制CTNNB1的表达可有效抑制细胞增殖，提示其可能参与了肿瘤的发生。

图1 特异性RNA干扰介导的CTNNB1蛋白表达下降

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Study on the growth of ovarian cancer cells after CTNNB1 gene silencing

Chen Fangxu,Liu Haiyan(Corresponding author),Liu Jianwei
The First Hospital Affiliated to Jinzhou Medical University 121001

Objective:To investigate the effect of CTNNB1 silencing on the proliferation of ovarian cancer cells.Methods:Human ovarian cancer SKOV3 cells were cultured in vitro,and then randomly divided into the blank control group,the negative control group and the CTN experimental group,and then transfected into shRNA vector plasmid targeting CTNNB1.Westernblot and MMT were used to detect the expression of CTNNB1 and cell viability.Results:CTNNB1 targeting shRNA can down regulate the expression of CTNNB1 protein in cells(P＜0.05).After transfection with CTNNB1 shRNA,the cell growth and proliferation of CTN group were significantly inhibited(P＜0.05).Conclusion:Down regulation of CTNNB1 gene can inhibit the proliferation of ovarian cancer SKOV3 cells.

Oophoroma;CTNNB1;ShRNA

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.16.1