miR-142-3p通过靶向CD133抑制鼻咽癌细胞和鼻咽癌干细胞生长的效果研究

汤国辉，张志伟，黄卫国，谢运杰，刑佼涛，贺修胜*

·论著·

miR-142-3p通过靶向CD133抑制鼻咽癌细胞和鼻咽癌干细胞生长的效果研究

汤国辉1，张志伟2，黄卫国2，谢运杰2，刑佼涛1，贺修胜2*

目的 明确miR-142-3p能否通过靶向CD133的表达进而抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭能力，探讨miR-142-3p在抑制肿瘤生长中的分子机制。方法 于2015年7月—2016年9月，构建CD133mRNA 3′-UTR荧光素酶报告载体，通过荧光素酶报告系统观察miR-142-3p对CD133mRNA 3′-UTR荧光素酶活性的影响。将对照control、CD133siRNA及miR-142-3p模拟物各40 μmol/L分别转染至鼻咽癌CNE2细胞，采用Western blotting法检测其对CD133表达水平的影响；设立阴性对照组〔瞬时转染对照control(40 μmol/L)〕、阳性对照组〔瞬时转染CD133siRNA(40 μmol/L)〕、miR-142-3p组〔瞬时转染miR-142-3p模拟物(40 μmol/L)〕、联合组〔瞬时共转染miR-142-3p模拟物(40 μmol/L)和pcDNA3.1(+)-CD1330.8 μg〕，MTS法检测4组对CNE2细胞增殖活性的影响，Transwell法检测4组对CNE2细胞侵袭能力的影响，干细胞成球实验检测阴性对照组和miR-142-3p组对CNE2干细胞成球能力的影响。结果 单光子荧光素酶活性检测结果显示，无miR-142-3p转染的pCD133-Wt型细胞荧光素酶活性为(0.924±0.107)，miR-142-3p转染的pCD133-Wt型细胞荧光素酶活性为(0.535±0.035)，两者比较，差异有统计学意义(t=7.924，P=0.022)。Western blotting法检测结果显示，阴性对照组、阳性对照组、miR-142-3p组CD133表达水平比较，差异有统计学意义(F=12.44，P<0.05)；其中阳性对照组和miR-142-3p组CD133表达水平低于阴性对照组(P<0.05)。阴性对照组、阳性对照组、miR-142-3p组、联合组CNE2细胞数量比较，差异有统计学意义(F=16.78，P<0.05)；其中阳性对照组和miR-142-3p组CNE2细胞数量低于阴性对照组(P<0.05)。Transwell侵袭实验检测结果显示，阴性对照组、阳性对照组、miR-142-3p组、联合组穿过基质胶的CNE2细胞数量比较，差异有统计学意义(F=13.19，P<0.05)；其中阳性对照组和miR-142-3p组穿过基质胶的CNE2细胞数量低于阴性对照组(P<0.05)。阴性对照组和miR-142-3p组干细胞成球数量比较，差异有统计学意义(t=14.92，P<0.05)。结论 miR-142-3p通过靶向调控CD133的表达而抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭及干细胞球的形成。

鼻咽肿瘤；肿瘤干细胞；细胞增殖；细胞侵袭

汤国辉，张志伟，黄卫国.miR-142-3p通过靶向CD133抑制鼻咽癌细胞和鼻咽癌干细胞生长的效果研究[J].中国全科医学，2017，20(17)：2085-2088，2094.[www.chinagp.net]

TANG G H,ZHANG Z W,HUANG W G,et al.miR-142-3p suppresses the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells and stem cells by targeting CD133[J].Chinese General Practice，2017，20(17)：2085-2088，2094.

microRNAs(miRNAs)参与调控生物的生长发育等过程，在细胞的分化、增殖、侵袭、转移、凋亡和衰老等多种生命活动中发挥重要作用[1]。研究表明，miR-142-3p在多种肿瘤的组织和细胞系中表达下调[2-3]，其可通过调控ABCG2、Lgr5等基因抑制肠癌细胞的增殖能力[4]。为探讨miR-142-3p在鼻咽癌中的作用及机制，本研究拟通过荧光素酶报告系统、Western blotting法、MTS增殖实验、Transwell侵袭实验等分子生物学技术证实miR-142-3p在鼻咽癌中是否通过靶向调控CD133的表达抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，进一步揭示miR-142-3p抑制鼻咽癌的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 实验于2015年7月—2016年9月进行。鼻咽癌CNE2细胞为人恶性鼻咽癌细胞，来自南华大学肿瘤研究所。miR-142-3p模拟物和阴性对照control为美国Ambion公司产品。CD133小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)由美国Invitorgen公司合成。鼠抗人CD133抗体和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，MTS细胞增殖/毒性检测试剂盒购自Promega公司。铺有基质胶的Transwell侵袭小室购自BD Biosciences公司。CD133过表达载体〔pcDNA3.1(+)-CD133〕购自GeneCopeia公司。

1.2 PROM1-3′-UTR(PROM1编码CD133蛋白)荧光素酶报告载体的构建 通过TargetScan软件6.2版本和miRanda软件检索miR-142-3p的靶基因，预测结果显示miR-142-3p可能与CD133mRNA 3′-UTR(第287～294位碱基)结合。根据CD133mRNA 3′-UTR序列，设计末端带Spe Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的特异性引物：以CNE2细胞DNA为模板PCR扩增CD133mRNA 3′-UTR。通过纯化、连接等步骤进行构建，挑取阳性克隆并测序鉴定。构建获得的野生型CD133mRNA 3′-UTR-荧光素酶报告载体命名为pCD133-Wt；突变型CD133mRNA 3′-UTR-荧光素酶报告载体命名为pCD133-Mut。

1.3 荧光素酶活性的检测 采用脂质体法将荧光素酶报告载体(pCD133-Wt和pCD133-Mut)分别与miR-142-3p模拟物或对照control共转染鼻咽癌CNE2细胞。同时转染pRL-TK载体作为标准内质控。转染48 h后，收获细胞，并用荧光素酶活性试剂盒进行荧光素酶活性分析。置入单光子检测仪测定，计算并统计分析数据。

1.4 Western blotting法检测CD133表达情况 将对照control(阴性对照组)、CD133siRNA(阳性对照组)及miR-142-3p模拟物(miR-142-3p组)各40 μmol/L分别转染至鼻咽癌CNE2细胞48 h后，提取细胞总蛋白，行10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离蛋白，转膜后，用含1%牛血清清蛋白封闭后，加入鼠抗人CD133单克隆抗体和β-actin单克隆抗体，4 ℃过夜。TBST洗膜10 min，加入二抗室温孵育1 h，再用TBST洗膜10 min，然后化学发光、X线曝光、显影、定影。

1.5 MTS法检测细胞增殖活性 取对数生长期CNE2细胞(1×105个)，实验共分4组：(1)阴性对照组〔瞬时转染对照control(40 μmol/L)〕；(2)阳性对照组〔瞬时转染CD133siRNA(40 μmol/L)〕；(3)miR-142-3p组〔瞬时转染miR-142-3p模拟物(40 μmol/L)〕；(4)联合组〔瞬时共转染miR-142-3p模拟物(40 μmol/L)和pcDNA3.1(+)-CD1330.8 μg〕。转染后，接种细胞于96孔板中，每孔接种3×103个细胞，每孔体积200 μl，重复6孔。37 ℃，5% CO2的细胞培养箱培养48 h，每孔加MTS液20 μl呈色。继续培养箱孵育4 h，终止并去除培养液。每孔再加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使结晶物溶解。选择490 nm波长，MTS比色，测定各孔吸光度值并记录结果。实验重复3次，绘制MTS曲线。

1.6 Transwell侵袭实验 取对数生长期CNE2细胞(1×105个)，实验共分4组：(1)阴性对照组〔瞬时转染对照control(40 μmol/L)〕；(2)阳性对照组〔瞬时转染CD133siRNA(40 μmol/L)〕；(3)miR-142-3p组〔瞬时转染miR-142-3p模拟物(40 μmol/L)〕；(4)联合组〔瞬时共转染miR-142-3p模拟物(40 μmol/L)和pcDNA3.1(+)-CD1330.8 μg〕。转染后将Transwell放入24孔板中，过夜干燥。在Transwell的上室内加入50 μl基质胶，加入无酶水200 μl/孔，直至干燥。待细胞生长至80%，加入DMEM培养基(含5%胎牛血清)。在上室内加入200 μl细胞悬液，在过滤器上均匀布满后放入培养箱培养36～38 h。10%甲醛溶液中固定Transwell 10 min，自来水清洗2次。将Transwell加入结晶紫5 min，在光学显微镜下观察、照相，随机选取4个低倍视野进行细胞计数，并计算平均值。实验重复3次。

1.7 干细胞成球实验 将CNE2细胞消化后计数，以1×103个细胞数接种至6孔板中，然后用干细胞培养液，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内培养48 h后，分别转染miR-142-3p模拟物以及对照control，培养96 h后，在倒置光学显微镜下观察干细胞成球的大小、数量(×200)并拍照。实验重复3次。

2 结果

2.1 miR-142-3p对CD133mRNA 3′-UTR表达的影响 单光子荧光素酶活性检测结果显示，无miR-142-3p转染的pCD133-Wt型细胞荧光素酶活性为(0.924±0.107)，miR-142-3p转染的pCD133-Wt型细胞荧光素酶活性为(0.535±0.035)，两者比较，差异有统计学意义(t=7.924，P=0.022)。无miR-142-3p转染的pCD133-Mut型细胞荧光素酶活性为(0.904±0.121)，miR-142-3p转染的pCD133-Mut型细胞荧光素酶活性为(0.897±0.115)，两者比较，差异无统计学意义(t=1.526，P=0.277)。

2.2 miR-142-3p对CD133表达的影响 Western blotting检测结果显示，阴性对照组CD133表达水平为(1.197±0.170)，阳性对照组CD133表达水平为(0.490±0.053)，miR-142-3p组CD133表达水平为(0.547±0.032)。3组CD133表达水平比较，差异有统计学意义(F=12.44，P<0.05)；其中阳性对照组和miR-142-3p组CD133表达水平低于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 CD133对鼻咽癌细胞增殖及侵袭力的影响 阴性对照组CNE2细胞数量为(0.812±0.024)，阳性对照组CNE2细胞数量为(0.440±0.051)，miR-142-3p组CNE2细胞数量为(0.481±0.013)，联合组CNE2细胞数量为(0.779±0.029)。4组CNE2细胞数量比较，差异有统计学意义(F=16.78，P<0.05)；其中阳性对照组和miR-142-3p组CNE2细胞数量低于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

Transwell侵袭实验检测结果显示，阴性对照组穿过基质胶的CNE2细胞数量为(40.000±3.000)，阳性对照组穿过基质胶的CNE2细胞数量为(14.333±2.517)，miR-142-3p组穿过基质胶的CNE2细胞数量为(16.000±2.000)，联合组穿过基质胶的CNE2细胞数量为(38.667±2.517)，4组穿过基质胶的CNE2细胞数量比较，差异有统计学意义(F=13.19，P<0.05)；其中阳性对照组和miR-142-3p组穿过基质胶的CNE2细胞数量低于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，见图1)。

注：A为阴性对照组，B为阳性对照组，C为miR-142-3p组，D为联合组

图1 Transwell法检测miR-142-3p对CNE2细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色，×100)

Figure 1 Invasion ability of CNE2 cells in negative control group,positive control group,miR-142-3p group and combined group detected by Transwell migration assay

2.4 miR-142-3p抑制CNE2干细胞的成球能力 阴性对照组干细胞成球数量为(15.667±1.528)，miR-142-3p组干细胞成球数量为(8.667±1.527)，两组干细胞成球能力比较，差异有统计学意义(t=14.92，P<0.05，见图2)。

注：A为阴性对照组，B为miR-142-3p组

图2 两组抑制CNE2干细胞的成球能力(×200)

Figure 2 Inhibition status of sphere-forming abilities of CNE2 stem cells in negative control group and miR-142-3p group

3 讨论

鼻咽癌是鼻咽黏膜上产生的恶性肿瘤，多发于中国华南地区，具有区域性，其中每10万人中约有50人发病，目前鼻咽癌的治疗手段虽然比较多，但其复发和转移也是治疗失败、患者死亡的主要原因[5]。因此鼻咽癌诊断与治疗的关键在于发现新的早期诊断标志物以及治疗靶点。

研究表明，肿瘤的转移、复发和耐药与肿瘤干细胞密切相关，肿瘤干细胞是一小类具有自我更新、无限增殖、多向分化能力的细胞，肿瘤干细胞为肿瘤的快速生长、转移、复发、耐药提供了坚实的基础[6]。肿瘤干细胞可较长时间地处于休眠状态，通过多种耐药分子降低对放疗和化疗的敏感性，导致肿瘤的复发[7]。CD133是多种实体瘤和血液肿瘤的肿瘤干细胞标志物，研究表明胃癌、黑色素瘤、肝癌等多种肿瘤中存在CD133表型的肿瘤干细胞，CD133为广谱肿瘤干细胞的标志物[8-10]。因此寻找肿瘤干细胞的作用靶点，并针对靶点对鼻咽癌进行干预是治疗肿瘤、防止耐药及复发的关键策略。

研究表明，miR-142-3p在多种肿瘤中存在表达下调的现象[2-3]，靶向调控CD133可抑制肝癌、肠癌细胞的生长、增殖和侵袭能力[11-12]。推测miR-142-3p在鼻咽癌中也可通过靶向调控CD133的表达抑制其肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。因此，本研究首先通过TargetScan和miRanda软件预测miR-142-3p的靶基因为CD133。随后通过荧光素酶报告基因实验和Western blotting实验验证CD133是miR-142-3p直接调控的靶基因，并且miR-142-3p可抑制CD133的表达。然后通过转染CD133siRNA阳性对照、miR-142-3p模拟物和阴性对照control，采用MTS和Transwell侵袭实验检测，证实干扰CD133的表达能显著抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭能力。最后证实miR-142-3p能抑制鼻咽癌CNE2干细胞的成球能力。即miR-142-3p可通过直接靶向抑制CD133从而抑制鼻咽癌细胞和鼻咽癌干细胞增殖和侵袭，miR-142-3p通过调控靶基因抑制肿瘤，起到抑瘤分子作用。

综上所述，miR-142-3p和CD133可作为鼻咽癌诊断和预后判断的新肿瘤标志物及治疗靶点。下一步拟继续深入研究miR-142-3p在鼻咽癌中的作用，阐明miR-142-3p参与鼻咽癌发生和发展的分子机制，为提高鼻咽癌的平均生存期及存活率奠定基础。

作者贡献：汤国辉、贺修胜进行文章的构思与设计、论文的修订、对文章整体负责，监督管理；汤国辉、谢运杰、刑佼涛进行研究的实施与可行性分析；汤国辉、刑佼涛进行数据收集；谢运杰、刑佼涛进行数据整理、统计学处理；汤国辉、张志伟、黄卫国进行结果的分析与解释；汤国辉、张志伟撰写论文；汤国辉、张志伟、贺修胜负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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[2]DENG B,ZHANG Y,ZHANG S,et al.MicroRNA-142-3p inhibits cell proliferation and invasion of cervical cancer cells by targeting FZD7[J].Tumour Biol,2015,36(10):8065-8073.DOI:10.1007/s13277-015-3483-2.

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[4]SHEN W W,ZENG Z,ZHU W X,et al.miR-142-3p functions as a tumor suppressor by targeting CD133,ABCG2,and Lgr5 in colon cancer cells[J].J Mol Med(Berl),2013,91(8):989-1000.DOI:10.1007/s00109-013-1037-x.

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(本文编辑：贾萌萌)

miR-142-3p Suppresses the Proliferation of Nasopharyngeal Carcinoma Cells and Stem Cells by Targeting CD133

TANGGuo-hui1,ZHANGZhi-wei2,HUANGWei-guo2,XIEYun-jie2,XINGJiao-tao1,HEXiu-sheng2*

1.DepartmentofAnusandBowels,AffiliatedNanhuaHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421002,China2.CancerResearchInstitute,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China*Correspondingauthor:HEXiu-sheng,Professor;E-mail：hexiusheng@hotmail.com

Objective To investigate whether miR-142-3p can suppress the proliferation and invasion abilities of nasopharyngeal carcinoma cells by targeting CD133,in order to reveal the molecular mechanism that miR-142-3p functions as a tumor suppressor in nasopharyngeal carcinoma.Methods This study was conducted between July 2015 and September 2016.CD133mRNA 3′-UTR-luciferase vector was constructed and dual-luciferase reporter gene assay was employed to examine the effect of miR-142-3p on luciferase activity of CD133mRNA 3′-UTR.Nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells were transfected with negative contrast control agent 40 μmol/L,CD133siRNA 40 μmol/L,and miR-142-3p mimics 40 μmol/L,respectively.Western blotting was performed to detect the expressions of CD133protein.CNE2 cells in logarithmic growth phase were divided into 4 groups,negative control group(transient transfection of negative contrast control agent 40 μmol/L),positive control group(transient transfection of CD133siRNA 40 μmol/L),miR-142-3p group(transient transfection of miR-142-3p mimics 40 μmol/L),and combined group〔transient transfection of miR-142-3p mimics 40 μmol/L and pcDNA3.1(+)-CD1330.8 μg〕.MTS assay and Transwell migration assay were used to detect the proliferation and invasion abilities of CNE2 cells,respectively.Tumorsphere formation assay was employed to detect the sphere-forming ability of CNE2 stem cells.Results Results of luciferase assay with single-photon detector showed that,the luciferase activity of pCD133-Wt cells with transfection of miR-142-3p was much lower than that of those without〔(0.535±0.035) vs.(0.924±0.107),t=7.924，P=0.022〕.Western blotting identified that,the expression of CD133differed significantly between negative control group,positive control group,and miR-142-3p group(F=12.44，P<0.05),concretely,the negative control group had higher expression of CD133than both positive control group,and miR-142-3p group(allP<0.05);obvious differences in the number of CNE2 cells were found among the 4 groups(F=16.78，P<0.05),specifically,negative control group had more CNE2 cells than positive control group,and miR-142-3p group(allP<0.05).Transwell migration assay revealed that,the number of CNE2 cells passing through the matrigel differed significantly among the 4 groups(F=13.19,P<0.05);negative control group had more CNE2 cells passing through the matrigel than positive control group and miR-142-3p group(allP<0.05).Tumorsphere formation assay demonstrated the number of sphere-forming CNE2 stem cells were more in negative control group than those in miR-142-3p group(t=14.92，P<0.05).Conclusion miR-142-3p suppresses cell proliferation and invasion,and sphere-formation of stem cells by targeting CD133in nasopharyngeal carcinoma.

Nasopharyngeal neoplasms;Neoplastic stem cells;Cell proliferation;Cell invasion

国家自然科学基金资助项目(81172210)；湖南省卫计委课题(B2013-048)

R 739.63

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.17.009

2016-12-20；

2017-04-15)

1.421002湖南省衡阳市，南华大学附属南华医院肛肠科

2.421001湖南省衡阳市，南华大学肿瘤研究所

*通信作者：贺修胜，教授；E-mail：hexiusheng@hotmail.com