川佛手中多酚类物质的微波和超声波联合提取工艺优化

邓 祥，黄小梅，王 芬

(1.四川文理学院 化学化工学院，四川 达州 635000； 2.“特色植物开发研究”四川省高校重点实验室，四川 达州 635000)



川佛手中多酚类物质的微波和超声波联合提取工艺优化

邓 祥1,2*，黄小梅1,2，王 芬1

(1.四川文理学院 化学化工学院，四川 达州 635000； 2.“特色植物开发研究”四川省高校重点实验室，四川 达州 635000)

采用微波和超声波提取技术，实现了川佛手中多酚类物质的有效提取. 在微波功率800 W和微波提取时间40 min的条件下，通过单因素实验条件优化，考察了超声功率、乙醇浓度、提取温度、超声时间和提取料液比对提取效率的影响；通过正交试验设计，确定了最佳提取工艺条件参数，即超声功率800 W、乙醇体积分数60%、提取温度55 ℃、超声时间1.0 h和提取料液比1∶20 g/mL；通过验证实验，得到川佛手多酚的提取率约为20.79 mg/g.

川佛手；多酚；微波；超声波

佛手(Bergamot)又名佛手柑，为芸香科植物佛手的干燥果实[1-2]. 佛手原产印度，传入我国种植已有700多年历史，现主要分布于四川、福建、广州和浙江等地，因其产地不同，佛手主要分为川佛手、建佛手、广佛手和金佛手等品种[3]. 佛手作为一种名贵的传统中药材，具有极高的药用价值[4-5]. 佛手中的药效成分主要包括挥发油类、多酚类、香豆素类和多糖类物质，由于其特殊的化学成分组成，佛手不仅应用于医药行业，也被广泛的应用于食品和化妆品行业[6-7]. 药典记载和研究表明：佛手醇提取物具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎、降血脂、降血糖和杀菌抑菌等多种药理活性[8-9]. 这些药理活性的影响因素是多方面的，其主要药效成分除与多糖类物质有关外，还与佛手中多酚类物质有关. 因此，研究佛手中多酚类物质的有效含量，对于判明川佛手潜在的开发利用价值具有十分重要的意义[10].

佛手中多酚类物质大多包裹在细胞壁中，采用传统的固液萃取和溶剂浸提方法提取效率较低. 微波和超声波辅助提取法是近年来发展起来的一种高效节能的植物有效成分提取技术，主要通过电磁场和超声波的物理作用，在不改变中药材有效化学成分的性能的基础上，能够缩短提取时间，显著提高提取效率[11-12]. 本研究以川佛手中的多酚类物质为研究对象，采用微波和超声波联合提取技术，通过单因素实验条件优化和正交试验，优化川佛手中多酚类物质的提取工艺，明确最佳工艺条件，为中药材中多酚类物质的有效提取提供技术参数.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

HN-1000D型超声波萃取仪(上海汗诺仪器有限公司)；MAS-2微波萃取仪(新仪微波化学科技有限公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津)；FA1104N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)；TG20-WS型离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；FW-135 型中草药粉碎机(上海五久自动化设备有限公司)； 101-2AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司).

川佛手(四川龙森中药材种植有限公司)；没食子酸标准品(上海试剂二厂)；福林酚试剂(国药集团化学试剂有限公司)；碳酸钠、硫酸铁、水杨酸、H2O2、无水乙醇均为分析纯试剂，实验用水均为二次蒸馏水.

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线绘制

以没食子酸作标准品，采用福林酚试剂(Folin-Ciocalteu, FC)显色法测定多酚含量[13]. 准确称取经干燥恒重的没食子酸标准品10.0 mg，用体积分数为60%的乙醇完全溶解，并定容至100 mL，得到0.1 g/L的对照品储备液. 从储备液中分别移取0、1.0、2.0、4.0、6.0 、8.0、10.0、12.0 mL于8个25 mL容量瓶中，依次各加入60%乙醇溶液至大约15 mL，福林酚试剂2 mL，混匀后静置2～3 min，再分别加入20%碳酸钠溶液4 mL，最后用60%的乙醇定容，摇匀，置于45 ℃的水浴锅加热5～6 min. 以第1瓶作对照，在765 nm最大吸收波长处测定吸光度，绘制标准曲线，如图1所示.

Each point is an average of three successive measurements.图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of measuring content of gallic acid

1.2.2 多酚提取及测定

将川佛手鲜果放置于35 ℃的真空干燥箱内恒温烘干，经粉碎后过60 目筛，除去大颗粒. 准确称取0.5 g川佛手粉末，置于离心管中并加入一定量溶剂，先用微波提取，然后用超声波提取，重复2～3次. 将提取物离心分离后收集于50 mL容量瓶中，用相应溶剂定容，再将定容后的提取液准确移取5.0 mL于25.0 mL容量瓶中，按1.2.1的方法处理得到吸光度，根据线性回归方程求算出多酚的提取浓度，再按下式计算川佛手的多酚提取效率[14-15].

其中：C—提取液多酚浓度(g/L);m—川佛手质量(g);V—提取液的体积(mL).

1.2.3 单因素实验条件优化

在单因素实验条件优化过程中，首先优化微波提取功率和提取时间，在优化后的微波提取功率800 W和提取时间40 min一定的情况下，先用微波提取，再用超声波提取，其他按1.2.1和1.2.2中的方法处理，得到川佛手中多酚的提取率. 实验中除固定微波提取功率和微波提取时间外，微波提取的其他条件与超声波提取条件一致. 着重讨论超声波提取过程中的提取功率、乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液比各因素对川佛手多酚提取效率的影响.

1.2.4 正交试验设计

根据单因素实验的条件优化结果，以多酚提取率为指标，在固定微波提取功率、提取时间和超声波提取功率的情况下，对其中乙醇体积分数A(%)、提取温度B(℃)、提取时间C(h)和料液比D(g/mL)四个因素进行正交试验，采用三水平四因素即L9(34)模式，见表1所示.

表1 L9(34)正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test L9(34)

2 结果与讨论

2.1 单因素实验条件优化

2.1.1 超声功率条件优化

在超声功率条件优化过程中，按实验方法准确称取6份川佛手粉末各0.5 g，分别加入12.5 mL无水乙醇，先用微波提取，然后在超声温度50 ℃的条件下，提取2.5 h，重复2～3次，优化超声功率对川佛手中多酚类物质提取效率的影响，其结果如图2所示. 在所测定的超声功率范围内，随着超声功率的增加，川佛手中多酚类物质提取效率不断增加，当功率提升到800 W时，多酚类物质的提取效率达到最大值并趋于稳定，所以实验过程中最适宜的超声功率为800 W.

Each point is an average of three successive measurements.图2 超声功率条件优化Fig.2 Ultrasonic power condition optimization

2.1.2 乙醇浓度条件优化

在乙醇浓度的条件优化过程中，准确称取6份川佛手粉末各0.5 g，分别加入12.5 mL不同浓度的乙醇，先用微波提取，再在超声功率800 W和50 ℃的条件下，提取2.5 h，重复2～3次，优化乙醇浓度对川佛手中多酚类物质提取效率的影响，其结果如图3所示. 在所测定的乙醇体积分数范围内，随着乙醇体积分数的不断增大，多酚提取效率不断增大，当乙醇体积分数在60%时，多酚提取效率达到最大，符合相似相容原理；之后，随着乙醇体积分数的增加，多酚提取效率反而下降. 究其原因是乙醇浓度过大，川佛手中的化学成分竞争溶出，从而限制了某些多酚类物质的充分溶解，提取率反而降低. 所以实验过程中选取体积分数为60%的乙醇为最佳乙醇浓度.

Each point is an average of three successive measurements.图3 乙醇浓度条件优化Fig.3 Ethanol concentration condition optimization

2.1.3 提取温度条件优化

在提取温度的条件优化过程中，准确称取6份川佛手粉末各0.5 g，分别加入12.5 mL体积分数60%的乙醇，先用微波提取，再在超声功率800 W的条件下，提取2.5 h，重复2～3次，优化提取温度对川佛手中多酚类物质提取效率的影响，其结果如图4所示. 在所测定的提取温度范围内，多酚类物质的提取效率对温度的变化十分敏感，在提取温度为60 ℃之前，多酚类物质的提取效率呈直线上升，这是因为温度越高，分子热运动加剧，多酚类物质集聚溶出，提取效率明显提高；提取温度在60 ℃之后，多酚类物质的提取效率下降显著，这是因为多酚类物质具有热不稳定性，温度过高，多酚类物质易于部分氧化和分解，导致了检测到的多酚提取效率显著降低. 因此确定50 ℃为川佛手多酚类物质的最佳提取温度.

Each point is an average of three successive measurements.图4 提取温度条件优化Fig.4 Extraction temperature condition optimization

2.1.4 提取时间条件优化

在提取时间的条件优化过程中，准确称取6份川佛手粉末各0.5 g，分别加入12.5 mL体积分数60%的乙醇，先用微波提取，再在超声功率800 W和60 ℃的条件下，重复提取2～3次，优化提取时间对川佛手中多酚类物质提取效率的影响，其结果如图5所示. 在所测定的提取时间范围内，随着提取时间的不断增加，提取率不断增大，当提取时间为1.5 h时，提取率达到最大，这是因为提取时间越长，多酚能充分有效溶出，提取效率较高；之后，随着提取时间的增加，提取率逐渐下降，这是因为提取时间过长，佛手中其他化学成分可能抑制部分多酚类物质的浸出，导致多酚的提取效率降低. 所以川佛手多酚类物质的最佳提取时间为1.5 h.

Each point is an average of three successive measurements.图5 提取时间条件优化Fig.5 Extraction time condition optimization

2.1.5 提取料液比条件优化

在提取料液比的条件优化过程中，准确称取6份川佛手粉末各0.5 g，分别加入12.5 mL体积分数60%的乙醇，先用微波提取，再在超声功率800 W和60 ℃的条件下，提取1.5 h，重复2～3次，优化提取料液比对川佛手中多酚类物质提取效率的影响，其结果如图6所示. 在所测定的提取料液比各组数据中，溶剂加入量较小时，多酚类物质的提取效率较低；随着溶剂加入量的增大，提取更充分，多酚类物质的提取效率也不断增加；溶剂加入量再增大，提取效率几乎没有变化. 为减少溶剂用量减低成本，因此确定川佛手多酚类物质的最佳提取料液比为1∶20 (g/mL).

Each point is an average of three successive measurements.图6 液料比条件优化Fig.6 Solid-liquid ratio condition optimization

2.2 正交试验

根据单因素实验条件优化结果，微波提取功率800 W、提取时间40 min和超声波提取功率800 W一定的条件下，对乙醇浓度、超声波提取温度、提取时间和料液比实验条件进行L9(34)正交试验，其试验结果见表2所示. 在正交试验中，极差R表示因素的影响大小，由R2>R1>R4>R3大小可以判断，影响川佛手多酚类物质提取效率的因素主次顺序为：提取温度>乙醇浓度>料液比>提取时间. 均值k表示各因素下不同水平实验结果的平均值，由均值k得到川佛手多酚的最佳提取工艺参数为：A2B1C1D2，即乙醇体积分数为60%，提取温度为55 ℃，提取时间为1.0 h和料液比为1∶20 (g/mL).

表2 L9(34)正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test L9(34)

2.3 验证实验

根据正交试验结果，在川佛手多酚的最佳提取工艺参数条件下，进行三组平行实验作为验证实验，其结果如表3所示. 在最佳提取工艺参数条件下，川佛手多酚类物质的提取率约为20.79 mg/g.

表3 最佳提取工艺参数条件下的验证实验结果Table 3 Results of the optimum process conditions

3 结论

本研究以川佛手中的多酚类物质为研究对象，采用微波和超声波提取方法，对川佛手中的多酚类物质进行了有效提取；采用福林酚试剂显色法和紫外分光光度法，实现了多酚类物质的有效检测；通过单因素实验条件优化和正交试验研究，得到了川佛手中多酚类物质的最佳提取工艺参数；通过验证实验，验证了最佳工艺条件参数. 在最佳提取工艺参数条件下，川佛手多酚类物质的提取率约为20.79 mg/g.

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[责任编辑：刘红玲]

Process optimization of microwave and ultrasonic extraction of polyphenols from Chuan Bergamot

DENG Xiang1,2*, HUANG Xiaomei1,2, WANG Fen1

(1.DepartmentofChemistryandChemicalEngineering,SichuanUniversityofArtsandScience,Dazhou635000,Sichuan,China; 2.KeyLaboratoryoftheResearchonCharacteristicPlantsofUniversitiesinSichuanProvince,Dazhou635000,Sichua,China)

Polyphenols were extracted from Chuan Bergamot by microwave and ultrasonic method. Under the condition of microwave power 800 W and microwave extraction time of 40 min, the effects of ultrasonic power, ethanol concentration, extraction temperature, ultrasonic time and extraction material/solvent ratio on extraction efficiency were studied by single factor experiment. The optimal conditions were determined as follows: ultrasonic power of 800 W, ethanol volume fraction of 60%, extraction temperature of 55 ℃, ultrasonic time of 1.0 h and extraction liquid ratio of 1∶20 g/mL. The results showed the extraction rate of polyphenols in Chuan Bergamot was about 20.79 mg/g.

chuan bergamot; polyphenols; microwave; ultrasonic

2017-01-17.

四川省科技厅应用基础研究项目(2015JY0033)，四川省教育厅重点项目(16ZA0356).

邓 祥(1974-)，男，副教授，主要研究方向为天然药物化学.*

,E-mail:dxw8066031@163.com.

TQ914.1

A

1008-1011(2017)03-0353-06