改良Sihler's神经染色法显示股前内侧区皮肤内神经分布

张 旗，孙 迎，杜星志，邓代进，杨胜波

(1.遵义医学院 临床医学系，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 人体解剖学教研室，贵州 遵义 563099)



技术与方法

改良Sihler's神经染色法显示股前内侧区皮肤内神经分布

张 旗1，孙 迎1，杜星志1，邓代进1，杨胜波2

(1.遵义医学院 临床医学系，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 人体解剖学教研室，贵州 遵义 563099)

目的 构建肉眼可见的股前内侧区皮肤内神经分布模式。方法 紧贴脂肪表面取下6具12侧甲醛固定的中国成年尸体股前内侧区皮肤。无水乙醇脱脂3d，胶原酶和胰酶消化3 d后，改良的Sihler’s神经染色法染色皮肤内神经。Photoshop软件测数神经纤维密度。结果 运用改良的Sihler’s神经染色法染色皮肤，肉眼即可观察到皮下和真皮内神经次级分支。真皮内可见神经扭曲与打结走行，神经分支间存在吻合。股前内侧区外侧、中间及内侧部的上、中、下1/3区神经密度分别为(0.90±0.31、1.46±0.67、1.84±0.67、1.66±0.79、2.77±0.77、2.60±0.78、3.86±1.10、4.99±1.38、6.65±1.39)根/cm2。即外侧部上1/3区最稀疏，内侧部下1/3区最密集。结论 改良的Sihler's神经染色法能清晰显示肉眼可见的股前内侧区皮肤内神经；这些结果为皮瓣移植感觉重建选材匹配和提高皮肤活检成功率提供了形态学依据。

Sihler’s神经染色法；股前内侧区；神经分布；皮肤；人

许多组织学技术已显示了皮肤各层内的神经纤维并测数了神经纤维密度，但局限于切片内观察[1-3]。尚缺乏一种通过肉眼即可整体观察到皮肤内细小神经分布的形态学证据。然而，Sihler’s染色法能清晰地显示肉眼可见的肌内神经分布模式[4]，但在本研究的前期预实验中发现，该方法却难以让皮肤透明。皮肤中富含胶原纤维[5-6]，是否为皮肤无法透明的原因，目前尚不清楚。有资料表明，股前内侧区外侧部皮肤，常作为万能移植皮瓣和活检诊断周围神经病的供体[7-8]。针对这大面积的区域，到底何处取材效果最好，有待研究。因此，本研究拟改良Sihler’s肌内神经染色法，显示肉眼可见的皮肤內神经分布模式，测数其神经密度，旨在为填补人股前内侧区皮肤内神经分布模式的解剖学资料、皮瓣移植感觉重建的选材匹配及提高皮肤活检成功率等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与大体解剖 选取来自遵义医学院人体解剖学教研室教学用过的无神经疾病、皮肤疾病及糖尿病史的经甲醛固定过的30～65岁中国成年人尸体6具(男4，女2)，按照局部解剖学界定的股前内侧区，紧贴肌表面取下两侧股前内侧区皮肤，观察神经来源后尽力剔除脂肪，不损伤皮肤。游标卡尺测量股前内侧区外侧、中间及内侧部的上、中、下1/3区的皮肤长度，宽度和厚度。

1.2 改良Sihler's神经染色法显示皮肤内神经 根据预实验中积累的经验，皮下脂肪厚的比薄的皮肤更难透明；用胶原酶和胰酶消化处理富含胶原的皮肤后更易透明；加大过氧化氢浓度可增加皮肤漂白程度[9]。因此，本实验需要重点改良浸解除色素这一步，关键是让皮肤透明或者半透明。①浸解除色素：先将取下的皮肤经无水乙醇脱脂3 d，0.25%胶原酶和0.25%胰酶消化3 d后，再进入Sihler's肌內神经染色法流程：为了漂白皮肤，将Sihler's染色法中0.2%的过氧化氢浓度提升5倍，即1%，3%的氢氧化钾溶液提升到4%～5%，浸解时间从原来的4周延长至5周，当肉眼观察皮肤全为白色时，将其置于X光阅片灯上，能看透皮肤即为理想的除色素；②脱钙：置入Sihler’s Ⅰ溶液(1份冰醋酸、2份甘油、12份1%水合三氯乙醛)中脱钙，从原来的4周延长至5周，直至轻度皱缩的皮肤重新透明；③染色：Sihler’s Ⅱ溶液(1份Ehrlich苏木素液、2份甘油、12份1%水合三氯乙醛)染色4周；④脱色：重新置入Sihler’s Ⅰ溶液进行脱色8～24 h；⑤中和：0.05%碳酸锂溶液中浸泡1～3 h。⑥透明：40%、60%、80%、100%梯度甘油中1周；⑦X光阅片箱上肉眼观察皮肤内神经分布模式并绘制模式图；⑧因皮肤在脱钙过程中会轻度皱缩，用游标卡尺重新测量皮肤长度和宽度，计算皮肤缩放系数：染色后皮肤面积÷染色前皮肤面积；⑨由于整块皮肤面积大，照相时难以捕捉到细小的神经，在染色标本上放置横向与纵向两个直尺，横向和纵向各放2根钓鱼线，将皮肤标本分成外侧、中间、内侧3部，每部进一步分为上、中、下3个区域，整块皮肤共分为9个区，微距下照相，再将9张照片组合在一起。

1.3 计数皮肤内神经分支密度 在Adobe PhotoShop 13.0软件下，打开原图，根据图片中直尺上的刻度，利用纵向和横向参考线工具，设置2 cm×2 cm大小的矩形框，从上向下，从左向右拖动参考线，计数各个部位皮肤内次级神经分支(真皮内)的根数[3,8]，一旦神经分支有跨越其它矩形框时，不再重复计数。不是矩形区域，用割补法计算皮肤面积和计数神经根数。神经总根数÷区域皮肤面积=区域内神经纤维密度；区域内神经纤维密度×缩放系数=校正后区域内神经纤维密度。

2 结果

2.1 大体解剖观察及测量 观察到股前内侧区皮肤的神经支配除了来自大的皮神经干外，大腿前外侧下部、前中部，以及前内侧下部均有穿过肌肉后来的细小分支。股前内侧区皮肤总面积为(688.89±36.56)cm2，平均厚度为(0.19±0.03)cm。股前内侧区外侧、中间及内侧部的上、中、下1/3区的皮肤面积和厚度见表1。中间部中1/3区面积最大，外侧部下1/3区最小；外侧部上1/3区最厚，内侧部下1/3区最薄。

2.2 改良Sihler's染色法染皮肤内神经所见 改良Sihler's染色法后，皮肤组织呈淡紫色，轻度皱缩，测得染色后与染色前皮肤面积的缩放系数为0.80±0.01，即缩减了20%。X线阅片灯上可透过皮肤肉眼见到真皮内的神经次级分支着为黑色，多数次级分支进一步树枝样分支，有的神经支走行扭曲，甚至打结，越来越细的神经支之间可见“Y”型，“U型”或“O”型吻合(图1～4)。由于解剖中剔除皮下脂肪时，部分皮下脂肪难以剔除干净，故肉眼也可见部分皮下脂肪内神经细支。染色的浸解过程中表皮常常脱落，即使不脱落，平铺的皮肤上也不能分界表皮与真皮，不能看见表皮内神经分支，但可见部分皮下脂肪和真皮内神经分布不均匀(图1～4)。

蓝色箭头指向皮肤内扭曲与打结走行的神经次级分支，标尺2.9cm。图1 改良的Sihler's染色法显示肉眼可见的股前内侧区中间部中1/3区局部皮肤内神经分布

A=股前内侧区外侧部上1/3区、B=外侧部中1/3区、C=外侧部下1/3区；D=中间部上1/3区、E=中间部中1/3区、F=中间部下1/3区；G=内侧部上1/3区、H=内侧部中1/3区、I=内侧部下1/3区。 图2 左侧股前内侧区皮肤内神经分布分区图

为了清晰显示实物图中细小的神经分支，图A～I中的红色方框区会特写在图4中。 图3 左侧股前内侧区皮肤内神经分布模式图

蓝色箭头指向皮肤中扭曲与打结走行的次级神经分支。标尺1.4 cm。 图4 左侧股前内侧区皮肤神经分布模式图9个区域内相应红方框的局部特写

2.3 股前内侧区各小区域神经纤维密度 股前内侧区外侧、中间及内侧部的上、中、下1/3区的神经纤维密度如表1所示，各区域间的比较，P<0.05，差异有统计学意义。内侧部下1/3区最密集，外侧部上1/3区最稀疏。各部各区域间密度大小依次为：内侧部下1/3区>内侧部中1/3区>内侧部上1/3区>中间部中1/3区>中间部下1/3区>外侧部下1/3区>中间部上1/3区>外侧部中1/3区>外侧部上1/3。左、右侧股前内侧区神经纤维密度比较，P>0.05，差异无统计学意义。

表1 股前内侧区9个小区域皮肤面积、厚度和真皮内神经密度

区域面积(cm2)皮肤厚度(cm)实测神经密度(根/cm2)校正后神经密度(根/cm2)外侧部上1/3区52.36±4.210.25±0.021.13±0.400.90±0.31外侧部中1/3区89.91±7.660.19±0.041.82±0.841.46±0.67外侧部下1/3区17.24±1.280.21±0.042.30±1.301.84±0.67中间部上1/3区81.25±6.530.17±0.262.20±0.991.66±0.79中间部中1/3区126.11±10.270.18±0.033.46±0.962.77±0.77中间部下1/3区85.52±6.790.17±0.243.25±0.982.60±0.78内侧部上1/3区94.29±8.380.24±0.044.82±1.373.86±1.10内侧部中1/3区125.01±9.870.19±0.026.22±1.734.99±1.38内侧部下1/3区81.45±6.710.17±0.038.31±1.746.65±1.39

3 讨论

皮肤的神经支配密集，其机械和伤害性感受器感受的神经冲动由位于三叉神经节和背根神经节神经元的周围突传至大脑。周围突终止于皮肤前，在皮下或肌筋膜间隙内形成粗细不等的皮神经，沿途树枝样分支[10]。神经进入皮肤后的细小分支，许多技术从组织学层面进行了证实，并作了神经纤维密度计数[1-3，11]，但这些研究仅局限于切片上观察，未能整体显示肉眼可见的皮肤内神经分布。

近十多年来，本实验室一直在应用Sihler’s染色法着色神经纤维髓鞘而清晰显示整肌内神经分布模式[12-14]，并寄希望该方法能清晰显示整块皮肤内神经分布，但前期实验中该方法不能让皮肤透明，笔者们考虑为皮下脂肪和皮肤内丰富的胶原影响了实验效果，本实验中便采用无水乙醇脱脂3 d，胶原酶和胰酶消化3 d后，再加大氢氧化钾浸解浓度和双氧水漂白浓度，以股前内侧区皮肤为对象，成功显示了肉眼可见的整块皮肤内的神经分支分布，证实了本文的假设。由于皮肤是整块摊开置于X线阅片箱上，可看见神经分支经皮下至真皮。真皮内以平行走行的次级神经分支为主，可见扭曲与打结走行现象(图1～4)，这一现象在诸多学者使用PGP9.5免疫组化染色显示皮肤内神经中也有这样的描述[8,15-16]。本实验中，为了清晰显示皮肤内细小神经，多数皮下脂肪被溶解去除，加上许多皮肤内神经可能直接来源于附近的肌内神经，导致看见的神经分支已经是一些真皮内的次级神经分支，不是皮神经干和初级神经支，也不是表皮内神经纤维。因此，本研究按照钱敏、Frahm等[3,8]的方法计数真皮内神经密度。然而，由于目前尚无揭示股前内侧区各个区域的真皮内神经纤维密度的资料，故本文暂不能与其他研究方法比较真皮内神经密度是否一致。

本实验选择股前内侧区为实验对象，一方面是因为该区域皮肤相对较薄，染色后可获得的成功几率高；另一方面，人们越来越注重感觉功能重建，尤其是对皮瓣修复创面特殊感觉功能恢复要求较高的部位，如手、口腔、足、阴茎及乳房等部位[17-20]。再一方面，可作为皮肤活检诊断小感觉纤维疾病的取材部位[8,21-22]。从本实验结果看出，股前内侧区外侧部下1/3区、中间部中1/3区、内侧部下1/3区的神经分布相对密集，提示这些区域应是皮肤移植感觉重建的良好供皮区和提高皮肤活检成功率的取材部位，这与卢范等采用显微解剖皮神经后建议选择的皮瓣移植区结论相吻合[23]；整体上看，外侧部上1/3区神经分布最稀疏，内侧部下1/3区最密集，这提示前者最不可取，后者较合适，因为皮瓣供区感觉神经的分布与皮瓣移植时皮神经及其吻合部位的选择是影响皮瓣感觉恢复的重要原因[24]，受区神经丰富的，理应选择供区神经丰富的进行匹配，多增加神经接触的机会。然而，外侧部上1/3区又是临床常用的皮瓣移植区，这是否提示了临床手术需要重新设计皮瓣移植的取材部位，有待进一步研究证实。另外，希望这些结果可为皮肤活检提供参考信息。

总的来说，本研究成功改良Sihler’s肌内神经染色法显示了股前内侧区皮肤内神经的分布模式，能借助肉眼直观的观察到该区域皮肤内神经密集区和稀疏区，是介于大体解剖学和组织学的一个过渡观察，为临床皮瓣移植感觉重建的选材匹配、提高该区域皮肤活检成功率提供了视觉信息，但皮肤内神经分布模式未能将皮神经干、初级神经分支及表皮内神经纤维一并显示，这些不足有待于进一步改良研究。

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[收稿2017-04-25;修回2017-05-12]

(编辑：王福军)

Using the modified Sihler's nerve staining technique to show the nerve distribution of anteromedial thigh region skin in humans

ZhangQi1,SunYing1,DuXingzhi1,DengDaijin1,YangShengbo2

(1.Department of Clinical Medicine,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China ；2.Department of Anatomy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To construct visible nerve distribution patterns of anteromedial thigh region in human skin.Methods Twelve sides lower limbs from 6 Chinese adult cadavers were fixed by formaldehyde.The skins of anteromedial thigh region were taken by closing to surface of subcutaneous fat.Then,these skins were defatted with absolute alcohol for 3 days,and were digested with collagenase and pancreatin for 3 days.After that,the nerves in the skins were stained by the modified Sihler’s nerve staining method,and then,the nerve fiber density in skins was counted by photoshop software.Results The modified Sihler's nerve staining method was used to stain the nerves in the skin,the secondary nerve branches in subcutaneous fat and the dermis could be seen by naked eyes,and the distorted and tied nerve shapes and the anastomosis between nerve branches could be observed.The nerve fibers density in upper,middle and lower 1/3 in the lateral,middle and medial parts of anteromedial thigh region were(0.90±0.31,1.46±0.67,1.84±0.67,1.66±0.79,2.77±0.77,2.60±0.78,3.86±1.10,4.99±1.38,6.65±1.39)/cm2,respectively,that is to say,the density in upper 1/3 region of the lateral part was sparsest,and the lower 1/3 region of medial part was densest.Conclusion The nerves in anteromedial thigh region skin stained by modified Sihler's nerve staining method can be clearly seen with naked eyes.These results provide a morphological basis for the selection and matching of sensory reconstruction of skin flap and the improvement of the successful rate of skin biopsy.

Sihler’s nerve staining method； anteromedial thigh region； nerve distribution； skin；human

国家自然科学基金资助项目(NO：31660294)；贵州省教育厅大学生创新创业计划项目(NO：201413653033)。

杨胜波，男，教授，硕士生导师，研究方向：骨骼肌与周围神经损伤，E-mail:yangshengbo8205486@163.com。

R322

A

1000-2715(2017)03-0318-05