安宫牛黄丸对大鼠脑缺血再灌注损伤和脑外伤的保护作用

颜俊文，陈 澜，王艳英，龚其海，刘 杰，石京山，张 锋

(1.遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院第五附属医院 神经内科，广东 珠海 519100)



基础医学研究

安宫牛黄丸对大鼠脑缺血再灌注损伤和脑外伤的保护作用

颜俊文1,2，陈 澜1，王艳英1，龚其海1，刘 杰1，石京山1，张 锋1

(1.遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院第五附属医院 神经内科，广东 珠海 519100)

目的 研究安宫牛黄丸对脑缺血再灌注损伤和脑外伤大鼠的保护作用。方法 成年雄性SD大鼠连续7 d灌胃给予安宫牛黄丸，灌胃第4天线栓法致脑缺血1 h再灌注72 h后检测大鼠行为学、脑梗死百分比及脑组织炎症因子肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素-1β (IL-1β)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达。此外，大鼠连续7 d灌胃给予安宫牛黄丸后，采用重物打击法诱导大鼠脑外伤模型，24 h后检测大鼠行为学改变并通过real time RT-PCR检测脑内炎症因子TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA的表达。结果 与脑缺血再灌注损伤模型组比较，安宫牛黄丸 (1.5 g/kg) 能够改善模型大鼠行为学改变，减少大鼠脑梗死面积，下调脑组织内TNF-α、IL-1β 和iNOS mRNA的表达；与脑外伤模型组比较，安宫牛黄丸 (1.5 g/kg) 可以改善大鼠行为学改变，下调脑组织内TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA的表达。结论 安宫牛黄丸对大鼠脑缺血再灌注损伤和脑外伤有保护作用。

安宫牛黄丸；缺血再灌注损伤；脑外伤；炎症因子表达；SD大鼠

脑外伤和脑缺血属于中枢神经系统急症,具有死亡率高和致残率高的特点。研究发现脑外伤后都有不同程度的颅内压增高,脑灌注压降低、脑缺血、缺氧,以后的病理过程与脑缺血相似[1]。然而，两者确切的发病机制及内在联系尚未完全阐明清楚。安宫牛黄丸应用于治疗脑外伤和脑缺血历史悠久[2]。安宫牛黄丸全方由牛黄、郁金、犀角、麝香、珍珠、栀子、黄连、黄芩、冰片、雄黄和朱砂11味药组成，是我国传统药物中最负盛名的急症用药，具有清热解毒、护肝、抗炎消肿、强心、扩张血管、镇静、抗惊厥等作用[3]。由于其含雄黄和朱砂，因此在国际市场被列为禁药。目前国内部分研究主张去除雄黄和朱砂，而我们前期的研究工作表明：雄黄和朱砂的毒性不能与其他常见砷、汞化合物毒性相提并论[4-5]。本研究旨在探讨安宫牛黄丸对大鼠脑缺血再灌注损伤和脑外伤是否具有保护作用，为此类中成药提供药效学的理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验药物 安宫牛黄丸购自贵阳德昌祥制药公司(批号20070915)。

1.2 动物 清洁级雄性SD大鼠72只、2月龄、体重(260±20)g，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心(合格证号：0004323)。常规大鼠饲料喂养，自由饮水。

1.3 试剂 Trizol、RNA纯化试剂盒以及所有引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司；大鼠大脑中动脉闭塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)栓线购自北京沙东生物公司。

1.4 仪器 实时荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司，型号：CXF content)；超速冷冻离心机(美国Beckman公司，型号：Microfuge 22R)；Leica图像分析系统(德国Leica公司，型号：Qwin Pro)。

1.5 方法

1.5.1 脑缺血再灌注损伤实验

1.5.1.1 实验分组及给药 雄性SD大鼠随机分成3组(n=8)：空白对照组、模型组、安宫牛黄丸组(1.5 g/kg)。大鼠每天灌胃给药1次，于第4天灌胃给药后采用MCAO线栓法造模，造模后继续灌胃给药3 d，给药结束的第2天进行行为学检测。空白对照组给予与药物等体积的生理盐水灌胃，共7 d。

1.5.1.2 脑缺血再灌注动物模型 大鼠用10%水合氯醛麻醉后，仰卧固定于手术台上，络合碘常规消毒皮肤，正中偏右切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织至右侧颈总动脉，沿颈总动脉向远心端分离至颈内、颈外动脉分叉，再向前分离少许，在动总动脉、颈外动脉下置丝线，结扎颈总动脉近心端、颈外动脉，动脉夹夹闭颈内动脉，用眼科镊从颈总动脉插MCAO线至大脑中动脉(以颈内、外动脉交叉处为标志，往里插入1.8 cm)，1 h后将栓线拔出约1 cm并剪断[6]，进行再灌注72 h。

1.5.1.3 行为学检测 将大鼠行为学评分分为6个等级[7]:0=大鼠未见活动异常；1=左前肢不能完全伸直；2=左前肢阻力减小,行走偏左侧；3=左侧旋转行走；4=原地左旋；5=完全性左瘫。

1.5.1.4 大脑梗死面积及重量比检测 评分后将大鼠麻醉处死，断头迅速取出大脑，放入-20 ℃冰箱中速冻20 min，用刀片把大脑冠状平均切成5片，放入盛有1%四氮唑红(2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride,TTC)溶液的玻璃瓶中，置37 ℃烤箱孵育约30 min(中途翻转2次)，非梗死区域被染成红色，梗死区没有被染上色而成白色。染色后，弃去TTC溶液，加入10%甲醛溶液，固定24 h后拍照，采用Image-ProPlus 5.0图像分析软件分析梗死面积。最后取出脑片，用滤纸吸除表面水分，分离大脑梗死区与非梗死区，分别称重，以大脑梗死部分重量比(梗死部分重量/大脑总重量)进行统计学分析。

1.5.1.5 Real-time RT-PCR检测脑组织TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA水平 大鼠脑缺血1 h 再灌注72 h后取大鼠全脑检测脑组织内肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β (IL-1β) 和诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) mRNA的表达。采用Trizol一步法从脑组织中提取总RNA，再用RNA纯化柱进一步纯化。用紫外分光光度仪检测RNA纯度。按逆转录试剂盒配制逆转录反应体系，采用MMLV 反转录酶和OligodT为探针进行逆转录反应。逆转录反应条件为： 25℃，10 min； 48℃，60 min； 95 ℃，5 min；产物cDNA 4 ℃保存。通过Icycler IQ 实时荧光定量PCR仪扩增：95 ℃预变性10 min； 95 ℃变性10 s；60 ℃退火1 min[8]。基因序列如表 1，以β-actin为内参。具体计算方法如下：以cycle time (Ct)值为统计参数依次计算下列数据：① Ct average =(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重复管)；② dCt =Ct average-中间值；③ 基因的表达=2^(-dCt)；④ 相对定量=目的基因的表达/内参基因的表达。

表1 引物序列

名称基因序号上游下游β-actinV01217TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCTGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGAATNF-αX66539TCGTAGCAAACCACCAAGCACCCTTGAAGAGAACCTGGGAGTAiNOSL12562GTGCTAATGCGGAAGGTCATGCGCTTCCGACTTTCCTGTCTIL-1βNM_031512CACCTCTCAAGCAGAGCACAGAGGGTTCCATGGTGAAGTCAACT

1.5.2 脑外伤实验

1.5.2.1 实验分组及给药 2月龄雄性SD大鼠，体重250～350 g，随机分为空白对照组、模型组、安宫牛黄丸组(1.5 g/kg)，每组8只大鼠。造模前1周每天灌胃给药1次，共7 d，给药结束的第2天进行行为学检测；空白对照组和模型组给予药物等体积的生理盐水灌胃。

1.5.2.2 动物模型制备 采用改进后的Feeney自由落体脑损伤装置，造成中度脑损伤[9]，具体方法和步骤为：7%水合氯醛麻醉，将大鼠固定于立体定位仪上，剪毛后消毒铺巾，矢状切开头皮，显露左顶骨，于中线左侧旁开约2.5 mm，前囱后约2.5 mm处钻开颅骨，保护硬膜完整，扩大骨窗至直径约5 mm。用20 g聚乙烯击锤从30 cm高处撞击头，造成左侧大脑半球中度脑损伤。撞击后，大鼠出现短暂的四肢抽搐、呼吸暂停数秒钟，表明致伤成功，随后清创、止血，缝合头皮，动物清醒后分笼喂养。

1.5.2.3 脑外伤后行为学检测 通过抓握牵引实验和平衡木实验观察大鼠脑外伤行为学改变[9]。抓握牵引实验的评分标准为：0=紧紧抓住绳子并迅速爬上；1=用后爪抓住绳子试图爬上，时间超过60 s；2=不依靠后爪悬挂在绳子上，时间超过60 s；3=悬挂30～60 s摔落；4=悬挂在30 s之内摔落。平衡木实验的评分标准为：0分=稳健地保持平衡；1分=可以保持一个稳定的姿势并维持60 s；2分=抱住平衡木超过60 s；3分=试图保持平衡，但在30～60 s滑落；4分=试图保持平衡，但在30 s之内滑落。将两种行为学检测的分数相加即为大鼠的最终得分，分数范围为0～8分。

1.5.2.4 Real-time RT-PCR检测TNF-α、IL-1β 和iNOS mRNA水平 大鼠脑外伤模型建立24 h后取大鼠全脑检测脑组织TNF-α、IL-1β 和iNOS mRNA的表达水平。方法同1.5.1.5。

2 结果

2.1 安宫牛黄丸对脑缺血再灌注损伤大鼠行为学的影响 与空白对照组相比，模型组行为学分数明显增高(P<0.05)；与模型组相比，安宫牛黄丸明显降低行为学分数(P<0.05，见表2)。

组别剂量(g/kg)行为学评分空白对照00模型04.5±1.2#安宫牛黄丸1.52.8±1.1*

#：与空白对照组比较，P<0.05; *：与模型组比较，P<0.05。

2.2 安宫牛黄丸对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积及重量比的影响 如图1和表 3所示，与空白对照组比较，模型组脑梗死面积较大；与模型组比较，安宫牛黄丸组脑梗死面积缩小。此外，与空白对照组相比，模型组梗死重量比明显增高(P<0.05)；与模型组相比，安宫牛黄丸明显减少脑梗死重量比(P<0.05)。

2.3 安宫牛黄丸对缺血再灌注损伤大鼠脑组织炎症因子mRNA表达的影响 与空白对照组比较，模型组TNF-α(10倍)、iNOS(20倍)和IL-1β(25倍)mRNA的表达明显增高；与模型组相比，安宫牛黄丸明显降低TNF-α、iNOS和IL-1β mRNA的表达(P<0.05)，抑制率分别为33%、48%和43%(见表3)。

图1 安宫牛黄丸对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积的影响

组别剂量(g/kg)梗死面积百分比(%)梗死部分重量比(%)TNFαiNOSIL-1β空白对照0008.7±0.65.4±0.33.6±0.5模型016.3±3.5#0.13±0.02#100.0±9.8#100.0±11.2#100.0±12.4#安宫牛黄丸 1.5 8.2±2.1*0.08±0.02* 67.2±5.3*52.1±6.8*56.7±4.5*

#：与空白对照组比较，P<0.05;*：与模型组比较，P<0.05。脑组织炎症因子mRNA表达是以模型组的表达值为100%，其他组与其进行比较。

2.4 安宫牛黄丸对脑外伤大鼠行为学的影响 与空白组比较，模型组行为学分数明显增高(P<0.05)；与模型组相比，安宫牛黄丸明显降低行为学分数(P<0.05，见表4)。

2.5 安宫牛黄丸对脑外伤大鼠炎症因子TNF-α、iNOS和IL-1β mRNA表达的影响 与空白对照组比较，模型组TNF-α(5倍)、iNOS(14倍)和IL-1β(25倍)mRNA的表达明显增高；与模型组相比，安宫牛黄丸明显降低TNF-α、iNOS和IL-1β mRNA的表达(P<0.05)，抑制率分别为49%、61%和58%(见表4)。

组别剂量(g/kg)行为学评分TNFαiNOSIL-1β空白对照00.9±0.919.2±3.46.2±0.74.1±0.5模型05.1±0.9#100.0±11.2#100.0±8.2#100.0±6.8#安宫牛黄丸1.52.8±1.4*51.4±7.2*38.5±5.6*42.3±5.1*

#：与空白对照组比较，P<0.05;*：与模型组比较，P<0.05。脑组织炎症因子mRNA表达是以模型组的表达值为100%，其他组与其进行比较。

3 讨论

研究防止脑外伤和脑缺血再灌注后神经损伤的药物，寻找有效的方法促进神经元的功能恢复，一直是相关生命学科研究的重要课题。但因脑外伤和脑缺血再灌注损伤后的神经修复机制十分复杂，然而临床上一直缺少疗效较好的药物。对于缺血性脑血管疾病，其是一个复杂的病理过程，缺血造成大脑损伤，再灌注进一步加重大脑损伤。大量证据显示自由基损伤、能量衰竭、酸中毒、细胞内Ca2+超载、兴奋性氨基酸毒性反应等与脑缺血/再灌注损伤的发生发展密切相关[10]。安宫牛黄丸是中药中极负盛名的急症用药，是中医治疗高热症的“瘟病三宝”之一，临床上主要用于治疗高热昏迷、脑出血、脑卒中[3]。最近研究发现安宫牛黄丸能够降低谷氨酸损伤神经元丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性从而发挥神经保护作用[11]。此外，安宫牛黄丸通过降低脑血肿周围组织含水量，提高红细胞变形能力，进而改善大鼠脑出血的神经功能障碍[12]。本研究发现安宫牛黄丸能够改善大鼠脑缺血再灌注损伤后的行为学变化，并减少脑梗死面积，表明安宫牛黄丸对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。另外，本研究发现安宫牛黄丸对大鼠脑外伤模型具有保护作用。脑外伤是一种临床上常见、死亡率高、后遗症多的神经损伤。目前脑外伤和脑缺血再灌注损伤的发病机制尚未阐明。最新的研究发现神经炎症反应在脑外伤后继发性脑损伤以及缺血再灌注损伤的病理生理过程中发挥关键作用[13]。而胶质细胞尤其是小胶质细胞被认为是神经炎症反应的关键环节[14]。脑外伤和脑缺血再灌注损伤发生后，小胶质细胞激活并释放大量炎性介质，如TNF-α、IL-1β、NO以及各种活性氧自由基等。这些炎症介质的不断产生和积累从而决定了周围神经元的存亡。然而，受损的神经元同时可以释放多种毒性物质，这些毒性物质能够进一步诱导小胶质细胞的激活，激活的小胶质细胞又可以再次释放炎症介质。综上所述，抑制神经炎症反应将成为治疗脑外伤和脑缺血再灌注损伤的重要靶点之一。本研究显示安宫牛黄丸能够改善脑外伤和脑缺血再灌注损伤大鼠的行为学改变，且抑制脑组织中炎症因子IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA 的表达；推测安宫牛黄丸可能通过减轻炎症反应，从而对脑外伤和脑缺血再灌注损伤产生保护作用。

总之，本研究发现安宫牛黄丸对大鼠脑缺血再灌注损伤和脑外伤具有保护作用，为安宫牛黄丸的临床应用提供了药效学依据，但其产生的神经保护作用机制还有待于进一步的研究。

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[收稿2017-03-23;修回2017-05-12]

(编辑：王静)

Protective effects of Angongniuhuang Wan on cerebral ischemia-reperfusion injury and traumatic brain injury in rats

YanJunwen1,2,ChenLan1,WangYanying1,GongQihai1,LiuJie1,ShiJingshan1,ZhangFeng1

(1.Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Neurology,Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519100,China)

Objective To study the effects of Angongniuhuang Wan (AGNHW) on cerebral ischemia-reperfusion and traumatic brain injury in rats.Methods Adult Sprague-Dawley (SD) rats were orally given AGNHW for consecutive 7 d.Brain ischemia was induced by middle cerebral artery occlusion (MCAO) through the suture-occluded method for 1 h followed by reperfusion for 72 h at the 4th day of AGNHW administration.The behavior,brain infarction areas and inflammatory factors mRNA expressions were tested.Moreover,rat traumatic brain injury was induced by dropping a 20 g weight from 20 mm heights after orally administration of AGNHW for consecutive 7 d.Twenty-four h later,the behavior was observed and rat brain inflammatory factors mRNA expressions were examined through real-time RT-PCR.Results In ischemia-reperfusion injury model,AGNHW (1.5 g/kg) was effective in improving the behavioral abnormality and reduced the infarction rate and suppressed the mRNA expressions of tumor necrosis factor (TNF-α),interleukin-1β (IL-1β) and inducible nitric oxide synthase (iNOS).In traumatic brain injury model,AGNHW (1.5 g/kg) attenuated rat behavior abnormality and inhibited TNF-α,IL-1β and iNOS mRNA expressions.Conclusion AGNHW is effective against cerebral ischemia-reperfusion and traumatic brain injury in rats.

Angongniuguang Wan; cerebral ischemia-reperfusion injury; traumatic brain injury; inflammatory factors expression; SD rat

国家自然科学基金资助项目(NO:81460556)；贵州省教育厅创新群体重大研究项目(NO:黔教合KY字[2016]038)；贵州省高层次创新人才项目(NO:黔科合人才[2016]4027)。

张锋，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：神经药理学，E-mail:zhangf@zmc.edu.cn。

R966

A

1000-2715(2017)03-0249-05