补肾健脾中药复方对骨质疏松骨折骨痂中CTGF、Osterix因子表达的影响

龚辉松

[摘要]目的 分析补肾健脾中药复方对骨质疏松骨折骨痂中CTGF、Osterix因子表达的影响。方法 选择6月龄清洁级健康雌性SD大鼠60只，随机分为3组：模型组、西药组和中药组，每组20只。骨质疏松骨折模型成功后，中药组和西药组分别给予补肾健脾中药复方和阿伦磷酸钠混悬液灌服，模型组进行常规培养，1个月后取各组骨折的骨痂，进行体外培养，各组骨痂给予对应含药血清进行培养。采用荧光定量PCR法检测各组CTGF、Osterix因子的表达。结果 在CTGF表达方面，中药组和西药组中的CTGF mRNA含量明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；在Osterix表达方面，中药组和西药组中的Osterix mRNA含量明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），且中药组的Osterix mRNA含量高于西药组（P<0.05）。结论 补肾健脾中药复方能在一定程度上促进骨痂的生长，从而促进骨折愈合，为骨质疏松性骨折愈合的机制和防治方法提供了一种新的途径。

[关键词]补肾健脾中药；骨质疏松骨折；骨痂；结缔组织生长因子；Osterix

[中图分类号] R683 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）05（a）-0063-04

[Abstract]Objective To analyze the influence of Chinese Herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen on CTGF and Osterix factor expression in callus of osteoporotic fracture.Methods 60 female SD rats of clean-class aged six-month were selected and they were randomly divided into 3 groups：model group，western medicine group and traditional Chinese medicine group （TCM group） （n=20）.After the success of the osteoporosis′ fracture model，TCM group was given Chinese Herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen and the western medicine group was given sodium alendate suspension.The model group was given routine culture.After 1 month，the callus of each group was taken and cultured in vitro.The callus of each group was cultured with the corresponding serum.CTGF and Osterix expression in each group were detected by fluorescence quantitative PCR.Results The expression of CTGF mRNA in TCM group and western medicine group was significantly higher than that in model group （P<0.05）.Osterix mRNA level in TCM group and western medicine group were significantly higher than those in model group （P<0.05），and the content of Osterix mRNA in TCM group was higher than that in western medicine group （P<0.05）.Conclusion Chinese herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen can promote the growth of callus to a certain extent，thus promote fracture healing，and it provides the new way for the mechanism and prevention and treatment methods osteoporosis′fracture healing.

[Key words]Chinese herbal medicine of tonifying kidney and strengthening spleen；Osteoporosis fracture；Callus；Connective tissue growth factor；Osterix

骨質疏松症最严重的并发症是骨质疏松性骨折，严重影响患者的生活质量。骨质疏松性骨折是由于骨强度下降所致。目前已知的影响骨强度的因素主要有骨量、骨微结构、骨的几何形状、皮质骨厚度和多孔程度、骨组织构成材料的内在性能等[1]。骨质疏松性骨折的防治已成为了全世界关注的课题。然而，目前国内外对骨质疏松性骨折愈合机制以及对骨质疏松性骨折局部骨痂的“质量”的研究相对较少，且主要针对体内环境中的骨痂进行探讨。本研究通过建立骨质疏松性骨折模型及骨痂组织体外培养体系，运用中药血清药理学的研究方法，模拟中药在体内作用于骨痂组织的模式，观察补肾健脾中药复方对体外环境中骨痂生物学特性的变化以及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、Osterix因子表达的影响，揭示补肾健脾中药复方对骨质疏松性骨折骨痂生物学特性影响的作用机制，为中医“肾主骨”理论提供实验依据。亦为研究骨质疏松性骨折愈合的生理病理机制和治疗方法提供一种新的思维模式。

1材料与方法

1.1试验动物

6月龄清洁级健康雌性SD大鼠60只，其体重为（260±30）g。随机分为3组：模型组、西药组和[l1]中药组；每组20只。所有动物均为广州中医药大学动物中心提供。

1.2实验药物

中药组采用补肾健脾中药复方灌服，药物的主要组成包括：黄芪12 g，补骨脂15 g，淫羊藿15 g，菟丝子12 g，肉苁蓉15 g，熟地15 g，白芍10 g等组成。根据临床用药剂量及新药研究中动物用药剂量要求，该方的提取药物，含生药量1.65 g/ml。西药组采用阿伦磷酸钠片配制成0.055 mg/ml浓度的阿伦磷酸钠混悬液（杭州默沙东制药有限公司提供，国药准字J20080069）。

1.3含药血清的制备

每组中10只大鼠给予相应的药物连续灌胃2周，其中西药组和中药组以蒸馏水定容至上述所需浓度，每日灌胃1次，模型组给予正常饮食。最后1次给予动物灌胃后的2 h，对动物行心脏采血。获得的全血置于含EDTA抗凝试管中，5～10 min后，以3000 r/min离心15 min，吸取上清，加以灭活，抽滤除菌，放置-20℃冰箱保存。

1.4 动物造模

每组中另外10只作动物模型，采用10%水合氯醛溶液作麻醉，以0.33 ml/100 g腹腔注射，待5 min后，大鼠麻醉完全，采用背侧入路行双侧卵巢摘除术以造模。3个月后，行骨密度检查，证实模型成功后，对各组麻醉，消毒右下肢，取膝内侧髌旁切口约1 cm，逐层分离切开，将髌骨及韧带向外侧推开，暴露膝关节，屈曲膝关节，暴露髁间窝，钻入0.5 mm克氏针，至股骨转子下，做髓内固定，剪断克氏针，残端长度以不影响关节活动为度。利用骨折发生装置将股骨造成闭合性骨折[2-3]。

1.5给药方法

骨质疏松骨折的模型成功后，各组开始灌胃治疗，灌胃给药容积为10 ml/kg，模型组灌服蒸馏水；西药组和中药组以蒸馏水定容至上述所需浓度，每日灌胃1次，治疗时间为1个月。

1.6骨痂的体外培养

摘取眼球取大鼠外周血3～4 ml，取血后处死，置于75%的乙醇浸泡15 min，置于无菌台上，切开皮肤及皮下，分离肌肉，暴露骨折段，取出骨痂，PBS漂洗后放于Eppendorf管作备用。大鼠处死前24 h禁食。将新鲜骨痂标本切成1 mm×1 mm×1 mm大小，经过两次含有青霉素及链霉素的PBS液漂洗后，放入培养板，加等量bGJB培养液，置于37℃，5%CO2中静置培养，24 h后换液，根据分组情况分别加用含药血清与bGJB培养液共同培养，1周后收集标本进行相关指标检测。

1.7 指标的检测及结果的计算

采用荧光定量PCR检测各组骨痂中的CTGF 和 Osterix 的mRNA含量。使用引物和探针设计软件Primer 5.0，除了考虑引物、探针设计的通用原则外，此引物Tm值要求在58～60℃，探针Tm值在68～70℃，以保证探针特异性杂交。序列表见表1。

按照抽提的总RNA应马上进行反转录：取2 μl RNA模板做逆转录反应，反转录反应程序：30℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min；取1 μl反转录产物（cDNA）进行荧光定量PCR。根据实时荧光定量RT-PCR的原理，以β-actin基因mRNA的表达为内对照。ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（β-actin），然后计算实验组各样本的ΔCt与对照组样本的ΔCt的差值，从而得到ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt（实验组）-ΔCt（对照组）。采用2-ΔΔCt进行计算。表示实验组测定基因的表达相对于对照组样本基因的表达的变化倍数，将2-ΔΔCt作为最后的定量结果用于统计分析。

1.8统计学方法

采用SPSS 16.0软件包分析，计量资料用x±s表示，采用方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

在CTGF表达方面，中药组和西药组的CTGF mRNA含量明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），但中药组与西药组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；在Osterix表达方面，中药组和西药组的Osterix mRNA含量明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），且中药组的Osterix mRNA含量高于西药组（P<0.05）（表2）。

3讨论

中医学认为骨质疏松属“骨痿“范畴。《素问·痿论》云：“此乃肾水不足，水不胜火；则骨枯髓虚，故足不任身，发为骨痿。”其病因病机，当首责于肾虚。由于各种原因导致肾（气、阴、阳）的不足，影响骨髓和血之化源，精不生髓，骨失髓血充养，易发生骨骼脆弱无力之证，即骨质疏松性骨折。同时，中医学亦认为骨质疏松性骨折愈合就是“瘀去、新生、骨合”的过程，且在“肾主骨”理论指导下进行组方用药，国内的研究[4]表明补肾中药提高了机体内分泌腺系统的功能，改善了下丘脑-垂体-性腺轴的功能，增加了体内的性激素，调整了内环境，从而达到抑制骨吸收，增加骨形成的目的，起到提高骨量的作用。魏合伟等[5-6]的研究已证明以“补肾法”拟定的中药骨康方对骨代谢有双向作用，既可抑制骨吸收，又可促进骨形成，缩短再造周期，提高骨生物力学性能，改善骨的质量，是一个较理想的治疗骨质疏松症的药物。同时，发现其含药血清中含有类性激素样作用的物质；能促进成骨细胞增殖和矿化，并促进成骨细胞分泌Ⅰ型胶原。

本研究所用方由黄芪、补骨脂、淫羊藿、菟丝子、肉苁蓉、熟地、白芍等组成，全方诸药共奏补肾壮骨、健脾益气之功效。该方以补骨脂补肾助阳壮骨为君药。辅之肉苁蓉、淫羊藿、菟丝子加强其补肾壮阳之功为臣药。同時配以黄芪补中益气；熟地、白芍滋阴益精，培补后天生化之源以充肾精，又可达到补中寓通，补而不滞的目的，共为佐药，故本方具有补肾壮骨、健脾益气的作用。

骨折修复的最终目的是尽可能恢复受伤骨的最大力学强度，修复骨折不仅要恢复骨形态的连续，更重要的是重建骨的支撑功能[7]。骨痂被认为是一种黏弹性物质，会随着骨愈合过程而发生变化，由此出现刚度与强度变化的不同步[8]。张胜利等[9]的研究表明，骨质疏松后，皮质骨和松质骨的生物力学性能均发生了改变：在骨折愈合的不同时期骨痂局部的形状、截面积、均匀性等发生变化，对于骨质疏松骨折而言，骨皮质变薄，骨弹性下降，骨脆性增加，骨骼的生物力学性能下降。随着分子生物学的发展，人们对骨折愈合的认识不断深化，现已知有大量的细胞生长因子在骨折愈合的不同阶段参与并调控了实质过程，如CTGF及Osterix因子对骨细胞的增殖和分化有重要作用。

CTGF是CCN家族中的成员，是一种由349个氨基酸组成，分子量为34～38 KD的富含半胱氨酸的分泌肽，目前该家族共有CTGF/fisp-12，cef10/Cyr61和Nov三个成员，参与了体内的多种病理生理过程，在骨折愈合中发挥重要作用。研究表明[10-11]，其可促进软骨细胞、生长板软骨细胞、肥大软骨细胞的增殖，并参与膜内骨化和骨建模或重塑，因此在维持骨量方面有重要作用。在本研究中，中药组和西药组的CTGF mRNA含量明显高于模型组，差异有统计学与意义，说明补肾健脾中药复方能进一步提高骨痂的生长。

Osterix是一种含有锌指结构的，对成骨细胞分化很重要的转录因子，属于Sp/XKLF家族，定位局限于细胞核。它只在发育的骨组织中特异表达，被Lee等[12]认为是直接调节骨形成protein-2-runx2通路主要因子。另一方面，Osterix被认为是sox9和软骨细胞的一种负向调控因子，可阻止骨或软骨的祖细胞向软骨细胞的分化。Baek等[13]的研究表明，Osterix失去可以延迟成骨细胞的成熟，导致不成熟的成骨细胞的积累和减少骨形成的成骨细胞功能的缺陷，无明显骨吸收，因此，认为Osterix在积极调控成骨细胞分化和骨形成具有重要作用。Kang等[14]用机械牵张力结合超声波刺激成骨细胞前体细胞，发现Osterix结合机械刺激可加速成骨细胞的基质成熟。Sinha等[15]认为，Osterix是成骨细胞特异性转录因子，它能激活早期成骨细胞分化成更多成熟的骨细胞。在本研究中，中药组和西药组中的Osterix mRNA含量明显高于模型组，差异有统计学意义，且中药组的Osterix mRNA含量高于西药组，差异有统计学意义，说明补肾健脾中药复方在提高骨痂的生长有明显的影响。

综上所述，补肾健脾中药复方能在一定程度上可促进骨痂的生长，从而促进骨折愈合，为防治骨质疏松性骨折、促进骨折愈合的治疗方法提供了一种新的途径。

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（收稿日期：2017-03-08 本文编辑：许俊琴）