根皮苷对糖基化低密度脂蛋白诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表达乳脂肪球表皮生长因子8的影响

张世阳，徐修才，焦莉莉，顾永昊，谈敏

(安徽医科大学附属省立医院，a 老年医学科,b 中心实验室,c 眼科，合肥 230001)

·基础研究·

根皮苷对糖基化低密度脂蛋白诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表达乳脂肪球表皮生长因子8的影响

张世阳a，徐修才b，焦莉莉a，顾永昊c，谈敏a

(安徽医科大学附属省立医院，a 老年医学科,b 中心实验室,c 眼科，合肥 230001)

目的 研究根皮苷(PHL)对糖基化低密度脂蛋白(gly-LDL)诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMVEC)表达乳脂肪球表皮生长因子8(MFG-E8)的影响，探讨PHL治疗糖尿病视网膜病变(DR)的作用及其机制。方法 体外培养大鼠RMVEC，分别进行不同浓度的gly-LDL与联合PHL+gly-LDL的处理。采用TUNEL方法观察不同处理条件下大鼠RMVEC的细胞凋亡。利用蛋白质免疫印迹方法(Western blotting)检测大鼠RMVEC 表达MFG-E8的变化。结果 与对照组相比，gly-LDL诱导大鼠RMVEC发生明显的细胞凋亡形态学变化，凋亡细胞的比例显著增多达到36.52%(P<0.01)，预先经PHL(800 μmmol/L)孵育后，细胞凋亡明显减少至20.45%(P<0.01)；与对照组(蛋白表达灰度值0.290±0.008)比较，gly-LDL诱导组蛋白MFG-E8表达明显降低，并呈现浓度依赖性(蛋白表达灰度值分别为0.215±0.009、0.165±0.002、0.117±0.014与0.092±0.004，P<0.01)；经PHL预处理后，gly-LDL诱导的MFG-E8表达明显升高，伴随PHL给药浓度的增加，MFG-E8的表达逐渐上调，差异有统计学意义(蛋白表达灰度值分别为0.343±0.008、0.373±0.002与0.404±0.006，P<0.01)。结论 PHL可能通过显著改善蛋白MFG-E8的表达，从而抑制gly-LDL诱导的大鼠RMVEC的细胞凋亡，实现对DR的保护作用。

糖尿病视网膜病变;根皮苷;脂蛋白类,LDL;表皮生长因子;大鼠,Sprague-Dawley

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是成年人群中视力损害与致盲的主要病因。DR的发病机制非常复杂，有研究认为，糖尿病环境中长期的高血糖以及脂质代谢异常导致低密度脂蛋白过度的糖基化，后者介导与促进血管内皮细胞的凋亡与内皮功能障碍是DR发生与发展的重要病理生理机制[1-3]。乳脂肪球表皮生长因子8(MFG-E8)最初认为是小鼠乳腺上皮细胞表面分泌的一种外周蛋白，晚近的研究发现MFG-E8参与了细胞凋亡、细胞外基质重塑以及炎症介导等多种生物学功能[4]。前期的蛋白质组学研究表明[5]，蛋白MFG-E8在db/db糖尿病小鼠视网膜组织表达明显下调，提示MFG-E8可能与DR密切相关。根皮苷(PHL)是一种来源于苹果类植物的天然药物，其治疗DR的作用已有多项基础研究结果证实[6-7]。本实验研究PHL对于糖基化低密度脂蛋白(gly-LDL)诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞(RMVEC)表达MFG-E8的影响，以探讨PHL治疗DR的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物、试剂与药品 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠来源于常州卡文斯实验动物有限公司，RPMI1640、M199培养基来源于美国Hyclone公司、TUNEL试剂盒购自瑞士Biotool公司、BCA蛋白定量试剂盒购自江苏凯基公司、鼠MFG-E8抗体购自英国Abcom公司、兔抗大鼠因子Ⅷ多克隆抗体与兔抗大鼠CD31多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，PHL购自中国天津尖峰天然药物研究开发有限公司(批号：1005004-19，纯度98%)。

1.1.2 仪器 细胞培养箱(Thermo Scientific 8000)、倒置拍照显微镜(Leica DMI3000B)、电泳仪(Bio-Rad Mini Protean 3 Cell)、电转仪(大连竞迈PS-9)与酶标仪(Thermo MK3)。

1.2 方法

1.2.1 体外分离、培养与鉴定大鼠RMVEC 体外分离大鼠视网膜以及体外培养大鼠RMVEC方法同文献[8]，利用倒置显微镜观察原代RMVEC的细胞形态。

1.2.2 大鼠RMVEC的体外鉴定 将培养的RMVEC接种于放油载玻片的培养皿中，至细胞爬满载玻片80%时弃培养液，取出培养皿，加入PBS 300 μL清洗2遍，加入150 μL 4% 多聚甲醛固定液，室温固定30 min。加入150 μL 0.1% Triton x-100，室温静置15 min。再加入300 μL的PBS，静置5 min。然后加入200 μL 5% BSA封闭液，置于37 ℃，5 % CO2培养箱1 h。分别加入50 μL兔抗大鼠CD31多克隆抗体(1∶50稀释)和兔抗大鼠因子Ⅷ多克隆抗体(1∶50稀释)，4 ℃过夜孵育。PBS洗涤后滴加FITC标记的羊抗兔二抗(1∶50稀释)，37 ℃孵育1 h。PBS甘油封片后荧光显微镜下观察。RMVEC纯度=免疫阳性细胞数/细胞总数。

1.2.3 gly-LDL的制备 LDL的糖基化制备方法参考文献[9]。制备的gly-LDL分装EP管氮气密封4 ℃避光保存。

1.2.4 细胞凋亡的检测 RPMI1640完全培养基将PHL稀释为800 μmol/L，将gly-LDL稀释为100 μg/mL进行实验。PHL提前与RMVEC预先孵育4 h，然后加入gly-LDL孵育48 h。实验分3组：对照组、gly-LDL组以及gly-LDL联合PHL组。TUNEL操作参考Biotool试剂盒说明书，软件ImageJ计算各组RMVEC细胞凋亡率。

1.2.5 RMVEC细胞表达蛋白MFG-E8的检测 分别进行两个阶段的独立实验检测不同处理条件下细胞蛋白MFG-E8的表达。实验分组一分为5组：空白对照组、gly-LDL 12.50、25.00、50.00与100.00 mg/L四个药物浓度组。实验分组二分为5组：空白对照组(CK)以及CK+gly-LDL、CK+gly-LDL+PHL 200 μmol/L、CK+gly-LDL+PHL 400 μmol/L与CK+gly-LDL+PHL 800 μmol/L(实验分组二中各组gly-LDL浓度均为100 mg/L)。按照Western blotting常规操作，包括各组细胞总蛋白提取浓度测定、SDS-PAGE制备上样电泳、转膜、目标蛋白抗体孵育以及显色等标准流程检测各相应分组RMVEC细胞MFG-E8蛋白表达的变化。并利用各显色条带的灰度值进行半定量分析。

2 结果

2.1 原代大鼠RMVEC的形态学特征 原代培养的RMVEC在24 h细胞贴壁生长，形状为梭形、三角形或多角形。5 d左右形成细胞集落。10 d后细胞融合，呈现铺路石样生长,见图1。

图1 原代大鼠RMVEC的形态学特征(×100)

2.2 原代大鼠RMVEC的体外鉴定 免疫荧光细胞染色显示，因子Ⅷ免疫荧光染色，细胞核周围出现较强的黄绿色荧光反应。CD31因子免疫荧光染色，细胞呈现特异性黄绿色荧光。大部分活细胞为免疫阳性细胞，纯度达到90%以上。见图2。

2.3 gly-LDL对大鼠RMVEC细胞凋亡的作用以及PHL的影响 对照组RMVEC细胞凋亡率为1.24%，gly-LDL(100 mg/L)诱导48h的RMVEC细胞凋亡率达到36.52%，经χ2检验，差异有统计学意义(P<0.01)，gly-LDL(100 mg/L)诱导组的细胞凋亡率显著高于对照组。PHL(800 μmmol/L)预先孵育后RMVEC细胞凋亡率为20.45%，与gly-LDL(100 mg/L)诱导组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(P<0.01)，PHL (800 μmmol/L)预先孵育RMVEC可显著降低细胞的凋亡。见图3。

2.4 gly-LDL对大鼠RMVEC细胞表达MFG-E8的影响 与对照组比较，gly-LDL处理48 h可导致RMVEC细胞表达MFG-E8显著下调，随着gly-LDL浓度的增加，MFG-E8的表达逐渐下调，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

2.5 PHL对大鼠RMVEC表达MFG-E8的影响 与对照组(CC)比较，gly-LDL诱导明显下调RMVEC细胞的MFG-E8表达(P<0.01)，PHL预先孵育48 h可以显著上调gly-LDL诱导的RMVEC细胞MFG-E8表达，随着PHL给药浓度的增加，MFG-E8的表达逐渐上调，差异有统计学意义(P<0.01)。见图5。

与对照组比较，aP<0.01；与gly-LDL组比较，bP<0.01

图3 gly-LDL(100 mg/L)对大鼠RMVEC细胞凋亡的作用以及PHL(800 μmmol/L)的影响

与对照组比较，aP<0.01

A：柱状图；B：电泳图

图2 原代大鼠RMVEC的体外鉴定(免疫荧光细胞染色，×200)

CC组为对照组；CC+gly-LDL组为gly-LDL诱导组；PHL 200组为联合PHL 200 μmmol/L组；PHL 400组为联合PHL 400 μmmol/L组；PHL 800组为联合PHL 800 μmmol/L组；与对照组比较，aP<0.01

图5 PHL对大鼠RMVEC表达MFG-E8的影响

3 讨论

DR是糖尿病在眼部的最重要并发症，现已成为成年人群中视力渐进性损害与致盲的主要病因。随着全球范围内糖尿病患病率的日益升高以及糖尿病病程的自然延长，DR给患者、家庭以及社会带来更多的危害与负担。研究[10]表明，严格的血糖控制能显著减低DR进展的风险，但在临床实践中长期控制血糖达标并非易事，而可能发生低血糖事件带来的危害更有可能抵消血糖良好控制的获益。激光光凝治疗DR效果确切，仍是中晚期阶段DR治疗的重要方法，但存在很多局限性与不良反应，如导致视力减退、视野损伤、暗适应和对比敏感度下降等，从而限制了其在临床上的广泛应用。因此，探讨DR早期的病理生理机制并寻找有效安全的干预药物具有重要的意义。

视网膜血管内皮细胞、血管周细胞以及神经元、神经胶质细胞等凋亡是DR早期的重要病理学基础，氧化应激损伤在促进细胞凋亡作用中发挥着重要作用[11]。PHL是一种天然的多酚类化合物，其主要来源于苹果类的植物种属。人类认识PHL已有近百年的历史，最初PHL用于治疗发热以及感染性疾病，随后的研究发现，PHL及其衍生物作为钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)抑制剂作用于肾小管SGLT蛋白促进葡萄糖在肾脏的排泄，因此PHL具有调节血糖的效应以及被作为中介研究肾脏代谢功能。晚近的研究还发现[12-13]，PHL具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保肝以及类雌激素样作用。相关报道与研究为PHL在DR上的应用奠定了实验与理论基础。目前已有多个基础研究深入探讨PHL对于DR的影响与作用。Wakisaka等[7]报道，体外培养的牛视网膜血管周细胞在高糖诱导后出现周细胞内葡萄糖过量积聚、胶原蛋白水平升高、DNA合成减少以及周细胞胞体的肿胀等血管周细胞形态与功能学的异常，PHL的干预可以显著改善高糖刺激下的周细胞损伤。我们前期的研究在体内动物整体层面观察了PHL对于糖尿病视网膜损害的影响，选择C57BLKS/J db/db品系小鼠模拟并建立2型糖尿病DR动物模型并采用PHL干预治疗，结果发现PHL处理能够明显减少db/db小鼠视网膜神经元细胞的凋亡以及神经胶质细胞的增生[5]。本研究模拟糖尿病内环境即利用gly-LDL刺激下体外培养的大鼠RMVEC导致细胞凋亡显著增加，PHL预先干预明显改善RMVEC的细胞凋亡，该实验结果报道了PHL可以改善gly-LDL诱导的大鼠RMVEC细胞凋亡，实现PHL对于DR的早期保护作用。然而，PHL治疗DR的作用分子机制研究尚未阐明。

MFG-E8蛋白即乳脂肪球上皮细胞生长因子，是乳凝集素家族的重要成员。研究发现MFG-E8参与了细胞迁移、细胞增殖、细胞凋亡、细胞信号转导、细胞外基质重塑以及炎症介质等多种生物学功能，并可能在衰老、糖尿病等动脉粥样硬化性相关疾病中扮演着重要角色。前期基于iTRAQ的蛋白质组定量研究视网膜差异蛋白组发现，db/db糖尿病小鼠视网膜组织表达蛋白MFG-E8较健康对照组明显下调，PHL干预后该蛋白显著回调，提示MFG-E8的代谢失调可能与DR的发生有着密切关系[5]。本研究在离体培养大鼠RMVEC细胞层面研究gly-LDL刺激下MFG-E8蛋白表达的变化，结果显示RMVEC细胞在不同浓度的gly-LDL诱导均导致表达MFG-E8的下调，MFG-E8的下调程度且与gly-LDL的浓度呈现剂量依赖性，给予RMVEC预处理PHL可明显改善gly-LDL诱导的MFG-E8表达下调，并且随着PHL浓度的升高，该蛋白MFG-E8的表达呈现剂量一致的恢复。MFG-E8介导的PHL保护糖尿病视网膜损伤的详细作用机制并不清楚。在真实世界的慢性阻塞性肺疾病、系统性红斑狼疮以及类风湿关节炎等患者血清中MFG-E8水平明显降低，且与患者的病变严重程度成正相关，MFG-8可能通过炎症介导参与了炎症相关性疾病的发生与进展[14-16]。MFG-E8作为连接巨噬细胞与凋亡细胞的桥梁分子在细胞凋亡的过程中发挥着独特而重要的作用。Ait-Oufella等[17]研究发现，缺乏MFG-E8基因表达的小鼠其体内凋亡细胞被吞噬明显减少，导致凋亡细胞呈现碎片化的堆积，促进了小鼠血管病变的发生与发展。凋亡是DR的发生的病理生理学基础，氧化应急损伤以及炎症在DR的进展中也发挥着举足轻重的作用，MFG-E8是否通过凋亡、炎症介导或其他机制参与DR的发展以及介导PHL对于DR的保护作用，后续研究将基于RNA干扰技术沉默目的基因深入探讨。

总之，本研究发现gly-LDL诱导大鼠RMVEC后，能够导致细胞的凋亡以及细胞表达MFG-E8蛋白的下调，PHL的预处理至少可能通过改善细胞MFG-E8表达的失调抑制RMVEC细胞的凋亡实现对于DR的保护作用。

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Effects of phlorizin on the expression of MFG-E8 in rats retinal microvascular endothelial cells in response to glycated low density lipoproteins

ZhangShiyang*,XuXiucai,JiaoLili,GuYonghao,TanMin

(*DepartmentofGeriatrics,AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

Correspondingauthor:XuXiucai,Email:xuxiucai1972@163.com

Objective To study the effects of phlorizin on the expression of MFG-E8 in rats retinal microvascular endothelial cells (RMVEC) in response to glycated low density lipoproteins (gly-LDL).Methods The primary RMVEC in rats were cultured and identified in vitro.The apoptosis of RMVEC induced gly-LDL was estimated using TUNEL.The expressions of MFG-E8 in RMVEC in the absence or presence of phlorizin were determined by Western blotting.Results Gly-LDL caused an obvious apoptosis of RMVEC compared with the control group (36.52% VS. 1.24%,P<0.01),while pretreatment with phlorizin attenuated gly-LDL mediated cells apoptosis significantly (20.45% VS. 36.52%，P<0.01).Moreover,stimulation of RMVEC with different concentrations of gly-LDL(0,12.50,25.00,50.00,100.00 μg/mL) resulted in a significant decrease in the expression of MFG-E8 (P<0.01),while the pretreatment of RMVEC with different concentrations of phlorizin (200,400,800 μmmol/L) significantly restored the gly-LDL induced decreased MFG-E8 levels in a dose dependent manner for 48h (P<0.01).Conclusions Phlorizin could inhibit RMVEC apoptosis in response to gly-LDL,possibly by the up-regulation of the protein MFG-E8 expression.

Diabetic retinopathy;Phlorhizin;Lipoproteins,LDL;Epidermal growth factor;Rats,sprague-dawley

安徽省自然科学基金(1408085MH208)

张世阳，副主任医师，Email:shiyangzhang73@163.com

徐修才，副主任技师，Email:xuxiucai1972@163.com

R587.26

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.04.029

2016-11-16)