左金丸血清药物化学研究

龚梦鹃 周祥羽 岳 贺 李春苑 王淑美 梁生旺 邹忠杰

广东药科大学中药学院/国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室/ 广东高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州 510006



左金丸血清药物化学研究

龚梦鹃 周祥羽 岳 贺 李春苑 王淑美 梁生旺 邹忠杰*

广东药科大学中药学院/国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室/ 广东高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州 510006

目的：对左金丸血清药物化学进行初步研究，通过分析入血成分探讨左金丸在大鼠体内的药效物质基础。方法：通过比较左金丸水煎液、口服左金丸及单味生药大鼠血清和空白血清HPLC图谱，初步鉴定左金丸在大鼠血清中的移行成分。结果：口服左金丸水煎液后在大鼠血清中发现14个入血成分，其中5个为原型成分，9个为代谢产物。结论：该研究建立的方法可用于左金丸水煎液血清指纹图谱和药效物质基础研究。

左金丸；血清药物化学；药效物质基础

中药血清药物化学是以传统药物化学方法为基础，综合利用色谱、质谱等多种现代分析技术，分析鉴定口服中药经吸收后的血清中移行成分，研究其与药效相关性，最终确定中药药效物质基础的应用学科。该方法目前得到广泛的认可和发展应用，是研究中药药效物质基础的主要方法之一。目前，已利用中药血清药物化学方法确定了单味中药及复方如杜仲[1]和三黄汤[2]等的药效物质基础。

左金丸源自朱丹溪的《丹溪心法》，方由黄连、吴茱萸(6∶1)组成，用于肝火犯胃、胃失和降所致的脘胁疼痛、口苦嘈杂、呕吐吞酸等，主治胃实热证。临床上要用于肝火犯胃型急慢性胃炎、反流性食管炎、功能性胃肠疾病、慢性萎缩性胃炎、消化道溃疡[3]等的治疗。左金丸可以通过抗炎[4-5]来治疗胃热证。本课题组利用代谢组学的方法证实左金丸可以有效干预胃热证大鼠紊乱的糖代谢、脂质代谢和氨基酸代谢[6]。目前，关于该方药效物质基础方面的研究还鲜有报道，本实验采用中药血清药物化学的相关理论和研究方法对左金丸进行研究，旨在探求该复方发挥药效的物质基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪(SPD-20A型紫外检测器，DGU-20A5型真空脱气机，CTO-10ASvp型柱温箱，SIL-20AC自动进样器，LC solution色谱工作站，日本岛津公司)；Cosmosil 5C18-MS-II 柱(4.6 mm×250mm，5μm，日本NACALAI公司)；AG135型电子天平(瑞士METTLER-TOLEDO公司)；1-14型低温离心机(德国 Sigma 公司)；QF-3800氮气吹干仪(绍兴市卫生医疗设备制造有限公司)。

1.2 药品与试剂 黄连和吴茱萸饮片购自广州采芝林药店，经广东药科大学中药学院韩彬教授鉴定为正品。乙腈(批号：1506098)为色谱纯，上海晶纯生化科技股份有限公司；屈臣氏蒸馏水；其余试剂为分析纯。

盐酸药根碱(批号：15050712)、盐酸小檗碱(批号：15010411)、盐酸巴马汀(批号：15032604)、表小檗碱(批号：15032526)、黄连碱(批号：15024568)、吴茱萸碱(批号：15032142)、吴茱萸次碱(批号：15042804)等对照品均购自北京天普标准品有限公司。

1.3 实验动物 雄性SD大鼠，体重(200±20)g，购自中山大学实验动物中心，动物合格证号：SYXK(粤)2012-0125，饲养于广东药科大学实验动物中心屏障环境设施中。

2 方法

2.1 左金丸、黄连、吴茱萸供试品溶液制备 黄连和吴茱萸以6∶1混合粉碎，10倍量蒸馏水浸泡1 h，煎煮2 h，双层纱布滤过出药汁，药渣再加8倍水煎煮2h，滤出药汁，合并两次药汁，加热挥发至浓缩液(0.14 g生药/mL)。浓缩液1.0mL 置 10mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，振摇，超声(功率100W，频率 40kHz)3min，3500rpm离心 5min，取上清液过 0.45μm 滤膜，即得。称取适量黄连和吴茱萸，分别10倍量蒸馏水浸泡1h，煎煮2h，双层纱布滤过出药汁，药渣再加8倍水煎煮2h，滤出药汁，合并两次药汁， 加热挥发至黄连浓缩液(0.12g生药/mL)、吴茱萸浓缩液(0.02g生药/mL)，浓缩液1.0mL 置 10mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，振摇，超声(功率100W，频率 40kHz)3min，3500rpm离心 5min，取上清液过 0.45μm 滤膜，即得。

2.2 混合对照品溶液制备 分别精密称取盐酸药根碱、黄连碱、表小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、吴茱萸内酯、吴茱萸碱和吴茱萸次碱1mg，分别置于10mL容量瓶中，用甲醇定容。分别取各对照品溶液1mL，混合为混合对照品。

2.3 空白血清及含药血清制备 取雄性SD大鼠，分为空白组和给药组，灌胃前禁食12h，各给药组分别灌服左金丸水煎液(1.4g生药/kg)、黄连水煎液(1.2g生药/kg)、吴茱萸水煎液(0.2g生药/kg)，空白组灌服等量蒸馏水，1h后1%戊巴妥钠麻醉，经腹主动脉取血，收集的血液样品室温下凝固60min后在3500rpm条件下离心15min得到血清。血清加入4倍量甲醇，涡旋30s混匀，在10000 rpm条件下离心3min，取上清液，于40℃条件氮气吹干后用100μL甲醇溶解，同上条件离心3min，取上清液，备用，供 HPLC 分析。

2.4 色谱条件 Cosmosil 5CI18-MS-II 柱(4.6 mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以添加0.3%甲酸、0.1%三乙胺、氨水调PH至8.6的水溶液为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序为：5%～10% A(0～5min)，10%～20% A(5～15min)，20%～40% A(15～30min)，40%～50% A(30～40min)，50%～70% A(40～50min)；柱温28℃；检测波长254nm；流速1mL/min；进样量10μL，进样前以流动相梯度初始条件平衡30 min。

2.5 左金丸及其血清中成分的分析 取左金丸供试品溶液、含药血清、空白血清和混合对照品溶液在相同的色谱条件下进行HPLC分析，建立HPLC指纹图谱，比较确定入血成分。

3 结果与讨论

实验通过比较单味饮片样品、复方样品、血清样品及对照品对照图谱的方法，采用相同的色谱条件进行检测，以保留时间作为鉴定标准，对色谱峰进行分析指认。通过对多个采血时间点的血清样品进行分析，发现在大鼠灌胃左金丸水煎液60min后，血中移行成分较多，特征峰丰富，强度较大，故采用60min的血清样品进行分析。实验利用二极管阵列(DAD)检测器进行紫外扫描检测，在208、210、220、230、250、254、260、280、300和320nm 10个波长下检测色谱图，发现254nm下基线较平稳，出峰较多，分离度较高，故确定为检测波长。

在本实验色谱条件下，经与左金丸水煎液、单味饮片、含药血清、空白血清比较分析确定入血成分的来源。大鼠灌胃左金丸水煎液的血清样品中共检测出14个移行成分(图1)，其中5、8、9、11、12号峰是体外生药中原型成分，1、2、3、4、6、7、10、13、14号峰推测为复方代谢产物，与对照品对比得知，8号峰是黄连碱，9号峰是表小檗碱，11号峰是盐酸巴马汀，12号峰盐酸小檗碱。此外，左金丸水煎液成分主要体现与黄连有关，吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量很少。邓雅婷等[7]曾研究表明黄连-吴茱萸药对的不同比例配伍对各主要组分溶出的影响不同。来自吴茱萸药材的成分随着配伍黄连比例的增大溶出增加。本实验中左金丸用到的黄连、吴茱萸以6∶1比例配伍，因此少量的吴茱萸配伍黄连后，吴茱萸碱和吴茱萸次碱的溶出减少，左金丸水煎液和左金丸含药血清中均无法检测到。

黄连水煎液及其血清样品色谱图见图2，大鼠黄连水煎液血清中共检测出10个移行成分，其中6、8、9、10号峰为体外生药原型成分，与对照品比较得知6号峰是盐酸药根碱，8号峰是黄连碱，9号峰是盐酸巴马汀，10号峰是盐酸小檗碱，1、2、3、4、5、7号峰推测为黄连吸收入血代谢成分。左金丸含药血清与黄连含药血清相比，没有盐酸药根碱的吸收峰，多了表小檗碱的吸收峰。因此，推测黄连在配伍吴茱萸后，入血成分盐酸药根碱被破坏，表小檗碱的入血质量分数提高而被检测到。

吴茱萸水煎液及其血清样品见图3，1号峰为吴茱萸入血代谢产物，2、3号峰经与对照品比较，确定为吴茱萸煎和吴茱萸次碱，但在血清中没有被检测出，推测可能入血质量分数太低或被机体代谢。

近年来，有学者利用色谱对单味药黄连和吴茱萸中成分及配伍后进行研究，发现没有新产生的吸收峰[8]，但黄连中生物碱溶出率明显增高[9]。分析图1和图2可看出黄连在与吴茱萸配伍后被机体吸收成分明显增多，3、10、13、14号峰是单味黄连所没有的峰(图1)，吴茱萸只有一个移行成分，为代谢产物(图3)，配伍作用初步推测为辅助增加复方中有效成分吸收入血。

实验运用HPLC法对左金丸血清药物化学进行了研究，初步分析了左金丸的入血成分，血中移行成分主要来自黄连，黄连碱、表小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱以原型成分吸收入血，初步推测其为治疗胃热证的药效物质基础。

药物血清化学成分的分析存在着含量低、组分多、分离难的特点，HPLC法仅适用于血清中有紫外吸收的成分，且灵敏度较低，亦无法对代产物进行定性[10]。因此，有待于结合更为灵敏的分析手段，进一步探究左金丸的体内效应物质。

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Preliminary Study on Serum Pharmacochemistry of Zuojin Pill

GONG Mengjuan ZHOU Xiangyu YUE He LI Chunyuan WANG Shumei LIANG Shengwang ZOU Zhongjie*

School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM, Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province, Guangzhou 510006, China

Objective To carry out a preliminary study on serum pharmacochemistry of Zuojin Pill and to further explore its pharmacoldynamic material basis through analyzing the constituents absorbed into blood.Methods The prototype components and metabolites in rat serum were identified through analysis and comparison of the HPLC fingerprints of Zuojin Pill, rat serum obtained after oral administration of zuojin Pill or single crude drug and blank serum. Results After rats were administered with Zuojin Pill, 14 transitional constituents in blood were detected, among which 9 were metabolites and 5 were prototype constituents.Conclusion The method established in this study can be used to research the serum fingerprint and material foundation of Zuojin Pill.

Zuojin Pill; Serum Pharmacochemistry; Material Basis

国家自然科学基金青年基金项目(81403075，81603397)。

龚梦鹃(1983-)，女，汉族，副教授，研究方向为中药药效学研究。E-mail:gongmengjuan@139.com

邹忠杰(1980-)，男，汉族，博士，教授，研究方向为中药药效物质基础研究。E-mail: zouzhongjie@139.com

R284.1

A

1007-8517(2017)11-0056-04

2017-04-11 编辑：程鹏飞)