链霉菌JD211发酵液对水稻防御稻瘟病菌诱导抗性的作用

徐志荣，傅雁辉，赵英杰，王 婷，魏赛金

(江西农业大学 生物科学与工程学院/江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西 南昌 330045)

链霉菌JD211发酵液对水稻防御稻瘟病菌诱导抗性的作用

徐志荣，傅雁辉，赵英杰，王 婷，魏赛金*

(江西农业大学 生物科学与工程学院/江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室，江西 南昌 330045)

为研究链霉菌JD211对水稻的抗性诱导机制，采用链霉菌JD211发酵液处理叶片，测定叶片中主要防御性酶活性及丙二醛(MDA)含量的动态变化，叶片表现出明显的抗稻瘟病菌作用。结果表明，不同浓度链霉菌JD211发酵液均能使水稻叶片中的过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性提高，MDA含量也逐渐升高，其中以20%链霉菌JD211发酵液浓度处理效果较好。

链霉菌JD211；水稻；防御酶；诱导抗性

近几十年以来，全球农业产量已通过作物品种改良和农业机械现代化得以较大提升，然而每年由各种植物病害造成的作物产量损失达25%以上[1-2]。水稻真菌病害的防治工作主要有抗病育种、化学农药防治和生物防治等[3]，其中使用化学农药可有效地控制真菌性病害进而稳定粮食产量。但是，长期大量喷洒化学农药极易造成环境污染，而且还会使病原菌产生抗药性；同时，农药残留可导致土壤中有益微生物的减少，进而抑制作物生长[4]。生物防治是借助自然的作用如调节环境、寄主、拮抗物(菌)或使用一种或多种拮抗物来完成的[5]，其可以减缓因使用化学农药带来的环境问题，能减少化学农药使用量[6-7]。

诱导抗病性(induced resistance，IR) 是指植物在一定的生物或非生物因子的刺激作用下，通过激活植物的天然防御机制，产生一种后天免疫功能，使植物免受或减轻病原物侵染的危害，诱导抗性可以在受侵染的部位局部表达，也可以在未受侵染部位系统性表达[8]。植物的保护反应是复杂的新陈代谢的结果，其生理反应主要是通过酶催化活动来实现的，过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物体内重要的防御酶，参与活性氧清除及酚类、木质素和植保素等抗病相关物质的合成，能抵御活性氧及氧自由基对细胞膜系统的伤害，增强植物对病害的抵抗能力，植株受到病原物侵染或是抗病激发子诱导后，其体内POD、PAL等活性都大大增加[9]。

链霉菌JD211是本实验室从江西庐山琪桐树中分离获得的一株拮抗放线菌。研究表明，其发酵液可显著抑制水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、烟草黑胫病菌、根霉、胶孢炭疽病菌、犁头霉、西瓜枯萎病菌等真菌的生长，其中对稻瘟病菌、烟草黑胫病菌等植物病原真菌的相对抑制率高达90%以上[10]；施加链霉菌JD211固体菌剂能显著提高水稻根际土壤酶活性，并且能抑制土壤病原微生物的数量，促进生态势较弱的功能菌群的生长，从而加速了土壤养分循环，增强了水稻的养分吸收，促进水稻生长，提高水稻秧苗的各种生理素质[11]。本研究利用链霉菌JD211发酵液处理水稻幼苗，从防御酶的角度探讨链霉菌JD211发酵液对水稻防御稻瘟病菌的抗性诱导机制。

1 材料与方法

1.1 材料

链霉菌JD211(StreptomycesJD211) 由江西省农业微生物资源开发与利用工程实验室从庐山珙桐植株中分离。稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)由江西省农业科学院惠赠。链霉菌JD211发酵液的制备参照黄国强等[12]的方法。

1.2 活体叶片的病情调查

把经20目土壤筛过筛的细土，装入长 60 cm，宽 30 cm，高 2 cm的长方形旱育秧塑料浅盘中，每盘中装细土 2 kg。水稻种子催芽后，每盆播种200 粒，置于温室中培养，保持适宜温度及湿度，生长至三叶一心期，分别喷洒含链霉菌JD211发酵液10%、20%、50%、100%的稀释液(含0.05% Tween80)，以含0.05% Tween80的蒸馏水为对照，喷稻瘟病菌的孢子，每处理重复3次。黑暗潮湿条件下室温培养5 d，在此期间每隔4 h喷水，至有水珠流下为止。观察被感染部位菌丝侵染情况并测量菌斑的长度，计算防效[13]，同时统计发病植株并计算发病率[14]。

1.3 离体叶片的病情调查

将水稻培养至分蘖期，用灭菌剪刀从叶鞘部剪断取分蘖期叶片，分别用30 mL含链霉菌JD211发酵液10%、20%、50%、100%的稀释液(含0.05% Tween80)浸泡10 min后，装入瓷盘中。每处理5片叶片，设3个重复，以含0.05% Tween80的蒸馏水为对照，另设不接菌的处理。在叶片上接入直径为5 mm的稻瘟病菌菌饼，保湿，用纱布、报纸覆盖，置于室温25 ℃，3 d后观察其变化(贴菌块法)，同时采用针刺叶片滴稻瘟病菌孢子的方法处理(滴孢子法)，3 d后统计发病情况、病斑长度，计算防效[13]。

1.4 链霉菌JD211对水稻抗性生理生化指标的影响

将发酵液稀释至20%、40%、60%、80%、100%(含0.05% Tween80)，以蒸馏水对照(含0.05% Tween80)，对水稻叶片喷雾处理，分别于处理后24、48、72、96、120 h 取水稻叶片用于检测相关防御酶活性。CAT、POD、PAL活性测定参照隋丽等[15]的方法；丙二醛(MDA)含量测定参照梅映学等[16]的方法。

1.5 计算公式

CK病斑长度为蒸馏水处理组病斑长度；Pt病斑长度为处理组叶片病斑平均长度。其中发病级数的定义为：无病为0级；少而小，病斑占叶面积1%以下为1级；小而多，或大而少，病斑占叶面积1%～5%为2级；大而多，病斑占叶面积5%～10%为3级；大而多，病斑占叶面积10%～50%为4级；50%以上，全将枯死为5级。

发病率(%)=(发病株数/调查总株数)×100

1.6 数据统计分析

采用DPS 7.05、Excel 2010进行数据处理并作显著性分析。

2 结果与分析

2.1 链霉菌JD211对活体水稻叶片抗稻瘟病效应的影响

与对照相比，喷洒20%链霉菌JD211发酵液可明显降低水稻叶片的稻瘟病发病率，发病率降低了37.5百分点。50% 链霉菌JD211发酵液处理组的防效最好，达到了91.72%(表1)。

表1 链霉菌JD211发酵液对活体水稻抗瘟效应

Table 1StreptomycesJD211 fermented liquid on the optimal ratio of rice blast resistance in vivo effect

2.2 链霉菌 JD211对离体水稻叶片抗稻瘟病效应的影响

如表2、图1所示，滴孢子处理组中50%链霉菌JD211发酵液浸泡叶片后，抗稻瘟病效果最好，防效达到了72.73%；贴菌块处理组中20%链霉菌JD211发酵液浸泡叶片后，抗稻瘟病效果最好，防效达到了97.39%。随着链霉菌JD211浓度增加，抗稻瘟病效果呈现先增后减的趋势，说明较低浓度链霉菌JD211发酵液能够在不破坏叶片组织的情况下，对稻瘟病孢子萌发起抑制作用，而高浓度处理可能伤害叶片组织而使抗病效果下降。

表2 链霉菌JD211发酵液对离体水稻叶片抗稻瘟病效应影响

Table 2StreptomycesJD211 broth on rice leaf blast resistance in vitro effect

链霉菌JD211浓度ConcentrationofJD211/%滴孢子Dropsofspores病斑平均长度Averagelengthoflesion/cm防效Controleffect/%贴菌块Pastefungusblock病斑平均长度Averagelengthoflesion/cm防效Controleffect/%04.4—6.90—101.565.913.3052.17202.250.000.1897.39501.272.730.7089.861002.836.361.7574.64

A， CK; B， 0; C， 10%; D， 20%; E， 50%; F， 100%图1 不同浓度JD211处理离体叶片感染水稻稻瘟病菌的情况Fig.1 Infection of leaves by different concentrations of Streptomyces JD211 in vitro

2.3 链霉菌JD211发酵液对水稻CAT活性的影响

由图2-A可知，喷施不同浓度的发酵液后24～120 h，CAT活性大多高于对照组。在48 h时，20%浓度处理的CAT活性达到峰值，为257.7 U·g-1，比对照增加了26.32%。在处理后120 h，各处理的CAT活性与处理后24 h时较为接近。

2.4 链霉菌JD211发酵液对水稻POD活性的影响

不同浓度的JD211发酵液喷施水稻叶片后，在不同时间内水稻的POD活性均高于对照(图2-B)。喷洒发酵液后24～72 h，POD的活性总体呈现下降趋势；喷后96 h，各处理的POD活性上升且均达到峰值；其中20%链霉菌JD211发酵液的效果最为明显，POD活性达到411.33 U·g-1，比对照高出202.44%。

图2 链霉菌JD211对水稻防御酶活性和MDA含量的影响Fig.2 Effect of different concentrations of Streptomyces JD211on defense enzyme activities and MDA content of rice

2.5 链霉菌JD211发酵液对水稻PAL活性的影响

喷施JD211发酵液后，各处理的PAL活性均高于对照(图2-C)。在喷施后48 h，PAL活性急剧上升，到达一个较高水平；40%链霉菌JD211发酵液处理的PAL活性在喷施后72 h达到峰值，为28.87 U·g-1，较对照增加48.58%。在96～120 h，各处理的PAL活性逐渐趋于稳定。

2.6 链霉菌JD211发酵液对水稻MDA含量的影响

由图2-D可见，以不同浓度JD211发酵液处理的水稻，在不同时间内MDA含量都受到了一定的影响。40%和60%链霉菌JD211发酵液处理在48 h出现峰值；80%和100%链霉菌JD211发酵液处理后72 h出现峰值。处理后72 h，以100%发酵液处理的MDA含量最高，为8.94 mmol·g-1，比对照增加了282.05%；20%发酵液处理的MDA含量相对较低，为3.68 mmol·g-1，较对照增加了42.08%。

3 小结与讨论

适宜浓度的链霉菌JD211发酵液对水稻稻瘟病菌有极显著的抑制作用。诱抗实验表明，其可能的作用机制是链霉菌JD211发酵液能够诱导植物体启动防御酶系，如POD、PAL等，使其参与植保素合成和特定的氧化反应，抵抗病原菌的侵染。植物体中H2O2有双重作用：一方面，适量的H2O2直接杀死病原菌，同时作为胁迫信号，可诱导一系列防御机制来保护植物细胞免受氧化胁迫；另一方面，过量的 H2O2会导致过氧化损伤，对植物体造成伤害，而CAT的主要功能是催化细胞内H2O2的分解，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害[17]。本试验表明，链霉菌JD211发酵液可使水稻叶片的CAT活性提高，这有可能是链霉菌JD211发酵液会使水稻叶片中H2O2含量升高，H2O2可以直接杀死外来病原菌，提高水稻抗病能力所致；同时水稻为减弱过氧化损伤，产生大量的CAT，以降解过多的H2O2，减轻其对植物体造成的伤害。

POD与植物的抗病性具有正相关关系，是植物保护酶系的重要保护酶之一。当受到外界胁迫时，POD活性的增强增加了酚氧化物的含量，可促进木质素的合成而使受侵组织木质化，从而抑制病原物的增殖及向植物体的其他部位扩展，增强植物抗病性[18]。本试验表明，JD211发酵液可以增强水稻叶片的POD活性，在处理后96 h，POD活性达到峰值，其中20%发酵液处理的POD活性最高，说明适宜浓度的发酵液可提高水稻叶片的POD活性。PAL是一种诱导酶，易被诱导而使活性变化，是木质素和植保素等抗性物质合成的关键酶，与植物防御病原菌侵染有密切关系，其活性升高，植物抗病性增强，活性降低，抗病性减弱[19]。本试验中，各浓度发酵液处理后，PAL活性均比对照组高，而且在处理后48 h达到峰值，说明JD211发酵液可在短时间内诱导PAL使其活性增加，加快合成木质素等抗性物质，增强水稻叶片对病原菌的抵御能力。

MDA是膜脂过氧化的终产物，其含量可用来反映植物对逆境条件的反应强弱[20]。在逆境条件下，细胞体内活性氧和自由基含量升高，而POD、CAT等是植物体内参与活性氧清除的重要保护酶，可抑制MDA的积累，维持细胞的稳定和完整，进而提高植物对逆境的适应性[21]。本试验中，不同浓度发酵液处理之后，MDA含量均比对照组高，整体趋势是浓度越大，MDA含量越高。20%发酵液处理时，MDA含量相比其他浓度要低，可能是该浓度处理下的POD、CAT等活性氧清除酶活性比其他浓度高，抑制了水稻叶片MDA的积累。链霉菌JD211发酵液处理水稻叶片，使水稻叶片中的CAT、POD、PAL活性提高，有效地抑制了MDA的积累，进而提高水稻叶片对稻瘟病菌的抗性，但链霉菌JD211发酵液中具体哪些活性成分参与诱导作用还有待进一步研究。

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(责任编辑 张 韵)

Effect ofStreptomycesJD211 fermentation products on the induced resistance toMagnaporthegriseain rice

XU Zhirong， FU Yanhui， ZHAO Yingjie， WANG Ting， WEI Saijin*

(CollegeofBiologicalScienceandEngineering/JiangxiAgriculturalMicrobialResourceDevelopmentandUtilizationEngineeringLab，JiangxiAgriculturalUniversity，Nanchang330045，China)

In order to study the effect ofStreptomycesJD211 fermentation products on the induced resistance of rice， the leaves were induced byStreptomycesJD211 fermentation products and exhibited obvious resistance toMagnaporthegrisea. Rice seedlings were treated with different concentrations ofStreptomycesJD211 fermentation products， and the dynamics of MDA contents and activities of defense enzymes in the rice leaves were measured. The results showed that the activities of CAT， POD and PAL in rice leaves could be improved by different concentrations ofStreptomycesJD211 fermentation products， as well as the MDA content. The 20%StreptomycesJD211 fermentation products showed the most significant effect.

StreptomycesJD211; rice; defense enzyme; induced resistance

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.16

2017-01-12

国家自然科学基金项目(31460469)

徐志荣(1991—)，男，江西南昌人，硕士研究生，主要从事天然药物研究。E-mail: xuzhirongjxnc@163.com

*通信作者，魏赛金，E-mail: weisaijin@126.com

S482

A

1004-1524(2017)06-0971-06