疏毛罗勒挥发油纤维素酶辅助提取工艺及其抗氧化作用的研究

王 庆，赵 冰，陈 娜

疏毛罗勒挥发油纤维素酶辅助提取工艺及其抗氧化作用的研究

王 庆1，赵 冰2，陈 娜1

目的 研究使用纤维素酶辅助提取疏毛罗勒挥发油的工艺，并测定挥发油的抗氧化性。方法 采用单因素试验和正交试验相结合的办法研究酶浓度、预处理温度、预处理时间对疏毛罗勒挥发油得率的影响，采用紫外分光光度法测定疏毛罗勒挥发油对羟自由基的清除率。结果 最佳提取工艺组合为酶浓度2 mg·mL-1、预处理温度45 ℃、预处理时间4 h。用最佳工艺进行预处理，疏毛罗勒挥发油得率可达0.62%，比温水浸泡预处理法和直接蒸馏法分别提高了16.98%和58.97%。疏毛罗勒挥发油具有较强的清除羟自由基活性的作用，EC50=4.846 mg·mL-1。结论 该工艺可用于疏毛罗勒挥发油辅助提取，疏毛罗勒挥发油具有较强的抗氧化性。

疏毛罗勒；挥发油；纤维素酶；提取工艺

唇形科植物疏毛罗勒(OcimumbasilicumL.)又名九重塔，原产非洲、美洲及亚洲热带地区，为药食两用芳香植物，具有化湿消食、疏风行气、活血解毒的作用[1]。现代科学研究表明，疏毛罗勒中含有较丰富的挥发油类化学物质，具有抗氧化、抗菌消炎等多种药理活性，是疏毛罗勒能防病治病的重要物质基础之一[2-4]。本研究采用纤维素酶预处理辅助提取疏毛罗勒挥发油，并对其清除羟自由基活性进行研究，希望为疏毛罗勒的开发利用提供基础数据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料 疏毛罗勒采自安徽省亳州市谯东镇，经亳州职业技术学院刘耀武教授鉴定，为唇形科植物疏毛罗勒的全草。纤维素酶活力为100 000 U·g-1，购于山东西亚化学工业有限公司，批号为L54738。石油醚、无水硫酸钠、硫酸亚铁、邻二氮菲、过氧化氢等均为分析纯。HDM型电加热套(上虞市鑫达试验设备厂)，RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHB-Ⅲ型循环水式正空泵(巩义市科学仪器有限公司)，HH-4恒温水浴锅(金坛市宏华仪器)。

1.2 方法

1.2.1 挥发油提取的工艺流程 将疏毛罗勒的地上部分剪碎，取100 g置于烧瓶中。按试验设计，在不同的酶浓度、温度、预处理不同的时间，之后按水蒸气蒸馏法提取2 h，提取终点以石油醚萃取，萃取物再以无水硫酸钠脱去水分，减压蒸发回收石油醚，得疏毛罗勒挥发油，按照下面的公式计算挥发油得率[5]。

其中m为提取获得的挥发油质量，M为参与提取的疏毛罗勒粗粉质量。

1.2.2 单因素试验 ①酶浓度对挥发油得率的影响控制预处理条件：酶浓度(0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg·mL-1)、预处理温度为40 ℃、预处理时间为1 h，预处理结束按“1.2.1”项的方法完成提取并计算挥发油的得率。②预处理温度对挥发油得率的影响控制预处理条件：酶浓度2 mg·mL-1、 预处理温度为(35、40、45、50、55、60 ℃)、预处理时间为1 h，预处理结束按“1.2.1”项的方法完成提取并计算挥发油的得率。③预处理时间对挥发油得率的影响控制预处理条件：酶浓度2 mg·mL-1、 预处理温度为50 ℃、预处理时间为(1、2、3、4、5、6 h)，预处理结束按“1.2.1”项的方法完成提取并计算挥发油的得率。

1.2.3 正交试验 根据单因素试验结果，将每个因素各选择3个较优水平，即酶浓度(1、1.5、2 mg·mL-1)、预处理温度(35、40、45 ℃)、预处理时间(2、3、4 h)，设计L9(34)型正交表进行正交试验，优选最佳预处理工艺。

1.2.4 清除羟自由基活性测定 在试管中依次加入pH=7.4的0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲液6 mL、12 mmol·L-1的硫酸亚铁溶液0.5 mL、12 mmol·L-1的邻二氮菲溶液0.5 mL、不同浓度的挥发油的95%乙醇溶液0.5 mL，最后加入0.16%的过氧化氢溶液，混合均匀，混合液在37 ℃水浴中恒温1 h，于510 nm处测定吸光度AX，用同体积的蒸馏水代替0.16%的过氧化氢溶液测定AX0，用同体积的蒸馏水代替挥发油的95%乙醇溶液测定吸光度A0，以VC作为对照。按照下列公式计算疏毛罗勒挥发油的羟自由基的清除率[6-7]。

2 结果

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酶浓度对挥发油得率的影响 由图1可知，当纤维素酶浓度小于2 mg·mL-1时，疏毛罗勒挥发油的得率随着酶浓度的增加而不断增大，但是当纤维素酶浓度大于2 mg·mL-1时，疏毛罗勒挥发油的得率几乎不再变化，说明酶浓度在2 mg·mL-1附近时，所有底物(疏毛罗勒)都已经和纤维素酶结合，增加纤维素酶浓度，没有与之结合的底物，提取率不再增加[8-9]。

图1 酶浓度对挥发油得率的影响

2.1.2 预处理温度对挥发油得率的影响 由图2可知，疏毛罗勒挥发油的得率一开始随着提取温度的增高而增加，当提取温度达到45 ℃时疏毛罗勒挥发油的得率最高，但是当温度超过45 ℃时挥发油的得率反而迅速下降。分析有两种可能，一是高温影响了纤维素酶的活性[10]，二是高温促使挥发油中的酯类等物质溶于水，在接下来的蒸馏过程中发生了水解[11]。

图2 温度对挥发油得率的影响

2.1.3 预处理时间对挥发油得率的影响 由图3可知，随着时间的增加，疏毛罗勒挥发油的得率一开始呈上升趋势，当预处理时间达到4 h时疏毛罗勒挥发油的得率最高，之后延长时间得率几乎不再变化，因此预处理4 h为较优的时间。

图3 温度对挥发油得率的影响

2.2 正交试验结果 由正交试验结果和方差分析可知，各因素对疏毛罗勒挥发油得率影响大小的顺序为酶浓度>温度>时间，其中酶浓度对疏毛罗勒挥发油得率具有显著影响。最佳提取工艺组合为A3B3C3，即酶浓度为2 mg·mL-1、预处理温度为45 ℃、预处理时间为4 h。见表1-2。

表1 各因素对疏毛罗勒挥发油正交试验结果

表2 各因素对疏毛罗勒挥发油方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00。

2.5 不同预处理方法对疏毛罗勒挥发油得率的影响 由于正交试验结果不包括最佳工艺组合，因此需做验证试验。由表3可知，以纤维素酶在最佳工艺条件下进行预处理，疏毛罗勒挥发油得率可达0.62%，高于正交试验中任何一组，比温水浸泡预处理法提高了16.98%，比直接蒸馏法提高了58.97%，效果明显。

表3 不同预处理方法疏毛罗勒挥发油得率结果

2.6 清除羟自由基活性测定结果 由图4可以看出，在测定浓度下，疏毛罗勒挥发油对羟自由基的清除能力低于VC，用PASW Statistics 18.0软件对实验数据进行处理，结果VC对羟自由基的EC50=3.213 mg·mL-1，疏毛罗勒挥发油对羟自由基的EC50=4.846 mg·mL-1。

图4 清除羟自由基活性测定结果

3 讨论

关于挥发油的提取，目前报道较多的主要有超临界CO2流体萃取法和水蒸气蒸馏法[12-13]。超临界CO2流体萃取法虽然提取率高，但是对设备要求高，成本较大，目前还难以实现大生产，水蒸气蒸馏法简单易操作，但挥发油提取率较低。纤维素酶可水解植物细胞壁，具有提取条件温和，时间短等特点，可显著提高有效成分的溶出度，近年来经常被用于天然产物中有效成分的辅助提取[14-16]。

抗氧化剂可代替人体的组织和细胞被自由基氧化而保护机体，在食品、保健品、药品等领域有广泛的应用。目前市场上最流行的是合成型抗氧化剂，但是其具有潜在的毒性，逐渐被人们排斥，从天然药物中寻找低毒高效的活性成分开发抗氧化剂已经成为研究的热点。天然的挥发油中含有较多不饱和基团，具有抗氧化的基础，近年来，关于挥发油的抗氧化活性时有报道。亳州产疏毛罗勒是罗勒的一个变种。

本试验采用纤维素酶预处理法辅助提取疏毛罗勒挥发油，并研究了其清除羟自由基的活性，结果，最佳工艺组合为酶浓度2 mg·mL-1、预处理温度45 ℃、预处理时间4 h，其中酶浓度对挥发油得率具有显著影响。用最佳工艺进行预处理，疏毛罗勒挥发油得率可达0.62%，比温水浸泡预处理法和直接蒸馏法分别提高了16.98%和58.97%。抗氧化结果表明疏毛罗勒挥发油对羟自由基具有较强的清除能力，EC50为4.846 mg·mL-1。

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Assisted Extraction by Cellulase of Volatile Oil inOcimumBasilicumL and Its Antioxygenation

WANG Qing1, ZHAO Bing2, CHEN Na1

(1.Bozhou Vocational and Technical College,Bozhou 236800,China; 2.Huatuo Medicines co.,Ltd, Bozhou 236800,China)

ObjectiveTo study assisted extraction by cellulase of volatile oil inOcimumbasilicumL and its antioxygenation.MethodsSingle factor test and orthogonal test were used to study effects of enzyme concentration, pretreatment temperature and pretreatment time on the yield of volatile oil fromOcimumbasilicumL. UV spectrophotometry was used to determine the scavenging rate of hydroxyl radical in volatile oil fromOcimumbasilicumL.ResultsThe optimum extraction process was that enzyme concentration was 2 mg·mL-1, pretreatment temperature was 45℃, and pretreatment time was 4h. Under the optimum pretreatment conditions, the yield ofOcimumbasilicumLvolatile oil was 0.62%. Compared with warm water soaking pretreatment and direct distillation method, the yield was increased by 16.98% and 58.97%, respectively. The volatile oil ofOcimumbasilicumL had a stronger role of scavenging hydroxyl radical, EC50=4.846 mg·mL-1.ConclusionThis process could be used for the assisted extraction of volatile oil fromOcimumbasilicumL, and the volatile oil ofOcimumbasilicumL has stronger antioxidant activity.

OcimumbasilicumL；volatile oil；cellulase；extraction process

1672-688X(2017)02-0097-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.02.005

安徽省教育厅自然科学基金重点课题(KJ2015A397)

2017-04-25

1.亳州职业技术学院，安徽亳州 236800 2.安徽华佗国药股份有限公司，安徽亳州236800

王庆(1982—)，女，安徽亳州人，讲师，从事药物活性成分提取分离研究工作。

R283.6

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