趋化因子受体CXCR4及基质金属蛋白酶9在非小细胞肺癌中的表达及其对预后的意义

黄衍杨，吴润华

趋化因子受体CXCR4及基质金属蛋白酶9在非小细胞肺癌中的表达及其对预后的意义

黄衍杨1，2，吴润华1

目的 探讨趋化因子受体CXCR4及基质金属蛋白酶MMP-9在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及临床意义。方法 应用免疫组织化学方法检测51例NSCLC患者癌组织及癌旁组织中CXCR4和MMP-9蛋白的表达情况，分析CXCR4和MMP-9蛋白表达与NSCLC临床病理特征及预后的关系。结果 CXCR4和MMP-9蛋白在癌组织中的表达阳性率均高于癌旁组织，差异有统计学意义(均P<0.05)；NSCLC癌组织中CXCR4及MMP-9的表达与肿瘤大小、TNM分期、是否淋巴结及远处转移相关(均P<0.05)；癌组织中CXCR4表达与MMP-9表达呈显著正相关(P<0.05)，Cox回归分析提示CXCR4和MMP-9蛋白表达、肿瘤大小、TNM分期、是否淋巴结及远处转移是影响NSCLC预后的独立因素(均P<0.05)。结论 CXCR4及MMP-9可能参与了NSCLC发生发展过程，二者高表达提示NSCLC患者预后不良，联合检测CXCR4及MMP-9的表达可更好地评估NSCLC患者的预后。

非小细胞肺癌；趋化因子；基质金属蛋白酶；预后

肺癌作为全球范围最为常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率一直居高不下[1]。最新的临床统计资料表明，2015年我国恶性肿瘤新发病例429.2万例，其中肺癌新发病例73.3万例，其发病率在男性恶性肿瘤中位居首位，而在女性中肺癌发病率也仅次于乳腺癌。2015年全国恶性肿瘤死亡病例281.4万例，其中肺癌死亡病例61万例，约占22%，位居我国恶性肿瘤死亡率首位[2]。资料表明90%以上肺癌病理类型为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[3]，尽管近年来NSCLC的诊断治疗方面已取得较大进步，但总体疗效仍不理想，5 a生存率仍然不足20%[1]，且对于NSCLC的发生及发展过程的相关分子机制仍不明确。新近研究表明趋化因子受体CXCR4可能与NSCLC肿瘤细胞增殖侵袭转移相关[4]。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)已被证实在多种恶性肿瘤的侵袭转移过程中发挥作用。研究发现CXCR4可能通过上调基质金属蛋白酶的表达而促进体外NSCLC细胞株的转移潜能[5]。本研究拟对CXCR4及MMP-9在NSCLC中表达的相关性及其与NSCLC患者临床病理特征、预后的关系进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例资料 本研究选取作者医院2008年至2010年治疗的原发性NSCLC患者51例(排除其他肿瘤并发者)，所有病例收集癌组织及距离癌组织3 cm以上的癌旁组织。所有患者术前或者收集标本前均未进行化疗、放疗等治疗，术后或者无法手术者均根据指南进行相应的辅助治疗。其生存期从确诊之日开始计算，终止日期为死亡日期或者末次随访日期，截止日期为2016年12月31日。所有病例均经病理组织学确诊为原发性NSCLC，均有完整的病例资料。

1.2 主要试剂 兔多抗CXCR4、MMP-9购自Abcam公司，Elivision试剂盒、胃蛋白酶、H2O2及内源性生物素阻断试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。

1.3 免疫组织化学检测 所有组织标本均经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm 连续切片，采用免疫组织化学Elivision法染色，严格按照试剂盒说明方法操作。石蜡切片脱蜡水化，高温枸橼酸盐煮沸抗原修复，3%H2O2孵育，生物素阻断剂阻断；分别加入一抗CXCR4、MMP-9多克隆抗体，工作液稀释比例均为1∶100，加入二抗反应，DAB显色，脱水，透明，封固。已知的阳性切片作阳性对照，PBS 代替一抗作为阴性对照。

1.4 免疫组织化学结果判定 两位病理科医师显微镜下独立观察，随机采集10个具有代表性的视野，根据染色阳性肿瘤细胞比例及染色强度进行评分。染色阳性细胞评分标准：①0分，≤10%；②1分，11%～30%；③2分，31%～50%；④3分，≥50%。染色强度评分标准：①0分，无染色；②1分，弱表达染色；③2分，中度表达染色；④3分，强表达染色。二者相加≥4分为该基因表达阳性。

1.5 统计学方法 运用SPSS 19.0软件进行统计分析。其中CXCR4、MMP-9表达与NSCLC患者临床病理特征的关系采用χ2检验，Spearman分析CXCR4、MMP-9表达的相关性，总体生存率采用Kaplan-Meier法分析，多因素Cox回归分析综合评价各因素对患者预后生存的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCR4、MMP-9的表达 免疫组织化学染色结果显示CXCR4、MMP-9在NSCLC癌组织中均呈强-中等强度阳性表达，阳性定位于细胞质及细胞膜上，而癌旁组织中仅散在弱表达于肺泡上皮细胞、浆细胞中，见图1-2。CXCR4和MMP-9蛋白在癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织，差异具有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

A：癌组织 B：癌旁组织图1 MMP-9的表达(DAB，×400)

A：癌组织 B：癌旁组织图2 CXCR4的表达(DAB，×400)

表1 CXCR4、MMP-9在NSCLC的表达 例

注：P<0.05为差异有统计学意义。

2.2 CXCR4、MMP-9的表达与临床病理特征 CXCR4的表达与NSCLC的年龄、性别、吸烟与否、组织病理类型及恶性分化程度无明显相关性(均P>0.05)，而与肿瘤大小、TNM分期、是否淋巴结及远处转移相关(均P<0.05)；MMP-9的表达与NSCLC的年龄、性别、吸烟与否、组织病理类型及恶性分化程度亦无明显相关性(均P>0.05)，也与肿瘤大小、TNM分期、是否淋巴结及远处转移相关(均P<0.05)，见表2。

表2 CXCR4、MMP-9的表达与NSCLC患者临床病理特征的关系 例(%)

2.3 CXCR4和MMP-9的相关性分析 Spearman相关分析显示NSCLC癌组织中CXCR4和MMP-9的表达呈正相关(r=34.895，P<0.05)，而在癌旁组织中CXCR4和MMP-9的表达并无相关性(rs=1.482，P=0.223)，见表2。

2.4 CXCR4、MMP-9表达与生存期 CXCR4、MMP-9表达阳性的患者生存率低于CXCR4、MMP-9表达阴性者，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表3。

表3 NSCLC患者预后影响因素分析

2.5 影响预后的Cox风险模型多因素分析 对可能影响NSCLC预后的相关因素：CXCR4和MMP-9表达、肿瘤大小、组织分化程度、TNM分期、是否淋巴结及远处转移等进行多因素Cox风险模型分析，结果提示CXCR4和MMP-9表达、肿瘤大小、TNM分期、是否淋巴结及远处转移均是影响NSCLC患者预后的独立危险因素。

3 讨论

众多研究表明细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的降解在恶性肿瘤细胞的侵袭转移过程中扮演重要角色。基质金属蛋白酶(matrix metallo-proteinases,MMPs)是一类锌离子依赖的蛋白内切酶，是人体内降解ECM的主要酶系。其中MMP-9又被称为Ⅳ型胶原酶，主要降解ECM基底膜的Ⅳ型胶原及层粘连蛋白而破坏基底膜的完整性，从而促进恶性肿瘤细胞的侵袭转移[6]。研究表明MMP-9的抑制剂则可通过降低肿瘤组织细胞中MMP-9的表达及活性而抑制肿瘤细胞的侵袭转移[7-8]。Lee等用免疫组织化学法检测了417例NSCLC癌组织中MMP-9的表达情况(其中腺癌患者202例，鳞癌患者175例，其他病理类型40例)，发现腺癌组织MMP-9的表达阳性率显著高于鳞癌组织，MMP-9的表达与NSCLC患者的TNM分期、淋巴结转移相关，并且肺腺癌患者中MMP-9的表达与患者的预后差相关[9]。然而Zhang等检测了132例手术治疗的NSCLC癌组织中MMP-9的表达情况(其中腺癌53例，鳞癌79例)，却发现肺鳞癌MMP-9的表达量要显著高于肺腺癌患者[10]。Gong等检测了163例NSCLC血清MMP-9水平及活性，发现血清MMP-9活性与NSCLC的T分期及远处转移相关，并对22份相关研究进行分析，发现NSCLC MMP-9的过表达与患者TNM分期及预后差相关[11]。

本研究应用免疫组织化学法检测NSCLC癌组织及癌旁组织中MMP-9的表达，发现MMP-9在NSCLC癌组织中呈强-中等强度阳性表达，阳性定位于细胞质及细胞膜上，而癌旁组织中仅于肺泡上皮细胞、浆细胞中少量表达，并且癌组织中MMP-9表达阳性率显著高于癌旁组织，提示MMP-9高表达可能参与NSCLC的发生。另外，本研究发现MMP-9的表达与NSCLC肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移及远处转移相关，然而与病理组织类型及组织分化程度无明显相关性。另外生存分析发现MMP-9表达阳性的NSCLC生存期显著短于MMP-9表达阴性患者，多因素Cox分析发现MMP-9表达、肿瘤大小、TNM分期、是否淋巴结及远处转移均是影响NSCLC患者预后的独立危险因素，提示MMP-9表达可作为NSCLC患者预后差的指标，与Lee及Gong等报道一致。

趋化因子受体是一类具有跨膜结构的G蛋白偶联受体，研究表明趋化因子受体家族通过与其特异性配体结合的方式参与了恶性肿瘤的发生发展。最早由Muller等于2001年首先报道人乳腺癌细胞中高度表达趋化因子受体CXCR4，而在乳腺癌常见的转移部位淋巴结及肺脏等组织中其相应配体CXCL12的表达也相应增加，提示CXCR4/CXCL12可能参与了乳腺癌的侵袭转移过程[12]。Choi等研究分别从动物和细胞水平证实了CXCR4通过CXCL12介导了NSCLC的侵袭转移行为[4]。Zhang等对研究的19份1 872个病例进行分析，发现NSCLC中CXCR4表达显著高于正常肺组织，NSCLC患者癌组织中CXCR4的表达与临床分期、远处转移及预后差相关[13]。

本研究结果提示CXCR4与MMP-9同样在NSCLC癌组织中呈强-中等强度阳性表达，阳性定位于细胞质及细胞膜上，而癌旁组织中仅散在弱表达于肺泡上皮细胞、浆细胞中。并且，CXCR4在NSCLC癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织，同时CXCR4在NSCLC癌组织中的表达与NSCLC肿瘤大小、TNM分期、是否淋巴结及远处转移相关，与胡婷华等报道一致[14]，提示CXCR4的表达可能参与NSCLC的发生发展。生存分析发现CXCR4表达阳性的NSCLC生存期也显著短于CXCR4表达阴性患者，多因素Cox分析发现CXCR4表达也是影响NSCLC患者预后的独立危险因素，与Zhang等报道一致。Mir等研究表明CXCR6可能介导MMPs表达增加而增强NSCLC细胞株的增殖及侵袭迁移能力[15]。石锋的细胞实验发现CXCL12/CXCR4分泌环促进了NSCLC细胞株的增值侵袭迁移能力，并上调了MMP-2及MMP-9的表达，提示CXCL12/CXCR4可能通过分泌MMP-2、MMP-9表达增加而促进NSCLC细胞株的侵袭转移潜能[5]。本研究发现NSCLC癌组织中CXCR4蛋白表达与MMP-9蛋白显著正相关，提示联合检测CXCR4及MMP-9的表达可能更好地评估NSCLC患者预后。然而NSCLC癌组织中CXCR4与MMP-9之间究竟存在怎样的通路关系，仍然有待进一步研究。

[1]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1):7-30.

[2] Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[3] Rami-Porta R,Bolejack V,Giroux DJ,et al.The IASLC lung cancer staging project: the new database to inform the eighth edition of the TNM classification of lung cancer[J].J Thorac Oncol,2014,9(11):1618-1624.

[4] Choi YH,Burdick MD,Strieter RM,et al.CXCR4,but not CXCR7,discriminates metastatic behavior in non-small cell lungcancer cells[J].Mol Cancer Res,2014,12(1):38-47.

[5] 石锋,郭苹.CXCL12/CXCR4自分泌环对人非小细胞肺癌细胞株A549转移潜能的影响[J].广东医学,2016,37(10):1442-1446.

[6]Vandooren J,VandenSteen PE,Opdenakker G.Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9): the next decade[J].Crit Rev Biochem Mol Biol,2013,48(3):222-272.

[7]Shi M,Cao M,Song J,et al.PinX1 inhibits the invasion and metastasis of human breast cancer via suppressing NF-kappaB/ MMP-9 signaling pathway[J].Mol Cancer,2015,14:66.

[8] Xia Y,Lian S,Khoi PN,et al. Chrysin inhibits tumor promoter-induced MMP-9 expression by blocking AP-1 via suppression of ERK and JNK pathways in gastric cancer cells[J].PLoS One,2015,10(4):e0124007.

[9] Lee CY,Shim HS,Chung KY,et al.Prognostic effect of matrix metalloproteinase-9 in patients with resected non small cell lung cancer[J].J Cardiothorac Surg,2015,10(44):1-8.

[10]Mu MK,Song Y,Zhang B.Expression and survival significance of B-cell-specific moloney murine leukemia virus integration site 1 and matrix metalloproteinase-9 in non-small-cell lung cancer[J].Oncol lett,2016,12(5):3715-3722.

[11]Gong L,Wu D,Yuan HJ,et al.Prognostic impact of serum and tissue MMP-9 in non-small cell lung cancer:a systematic review and meta-analysis[J].Oncotarget,2016,7(14):18458-18465.

[12]Muller A,Homey B,Zlotnik A,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J].Nature,2001,410(6824):50-56.

[13]Zhang CY,Li J,Han Y,et al.Ameta-analysis for CXCR4 as a prognostic marker and potential drug target in non-small cell lung cancer[J].Drug Des Devel Ther,2015,9:3267-3278.

[14]胡婷华,姚煜,南克俊,等.非小细胞肺癌组织中CXCR4和Nrf2的表达及其临床意义[J].南方医科大学学报,2014,34(2):153-158.

[15]Mir H,Singh R,Singh S,et al.CXCR6 expression in non-small cell lung carcinoma supports metastatic process via modulating metalloproteinases[J].Oncotarget,2015,6(12):9985-9998.

Expression of CXCR4 and MMP-9 in Non-small Cell Lung Cancer and Its Clinical Prognosis

HUANG Yan-yang1,2, WU Run-hua1

(1.Teaching Center for Clinical Skill,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China; 2.Department of Pulmonary Medicine, People′s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350004, China)

ObjectiveTo investigate the expression of CXCR4 and MMP-9 in non-small cell lung cancer(NSCLC) tissues, and analyze their clinical prognosis significance.MethodsThe expressions of CXCR4 and MMP-9 proteins were detected by immunohistochemistry in tumor tissues and corresponding adjacent normal tissue from 51 NSCLC patients. The relationship between CXCR4 and MMP-9 expression in tumor tissues and clinicopathological characteristics and prognosis of NSCLC were analyzed.ResultsThe positive expression rates of CXCR4 and MMP-9 proteins in tumor tissues were significantly higher than those in the corresponding adjacent normal tissue(allP<0.05). A high expression rate of CXCR4 and MMP-9 were significantly associated with tumor size, TNM stage, lymph node metastasis and distant metastasis(allP<0.05). There was a positive correlation between CXCR4 and MMP-9 expression in tumor tissues. Cox regression analysis indicated that the expression of CXCR4 and MMP-9, tumor size, TNM stage, lymphnode metastasis and distant metastasis or not were independent predictors of prognosis for NSCLC.ConclusionCXCR4 and MMP-9 might be involved in the development of NSCLC malignant process, and their high expression might indicate poor prognosis in patients with NSCLC.

non-small cell lung cancer；chemokine；matrix metalloproteinases；prognosis

1672-688X(2017)02-0092-05

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.02.004

2017-04-25

1.福建中医药大学临床技能教学中心，福建福州 350122 2.福建中医药大学附属人民医院肺病科，福建福州 350004

黄衍杨(1983—)，男，福建龙岩人，医师，从事呼吸病学临床工作。

吴润华，女，博士，讲师，E-mail：wu_runhua@126.com

R734.2

A