柴黄清胰活血颗粒乙醇提取工艺

赵剑+李静+李志+蒲清荣+黄锐+罗群

摘要：目的优选柴黄清胰活血颗粒的最佳乙醇提取工艺。方法采用乙醇回流提取法、乙醇超声提取法和乙醇渗漉提取法，提取柴黄清胰活血颗粒中部分中药材，用HPLC法测定其指标性成分延胡索乙素的含量，选取延胡索乙素含量最高的提取方法作为柴黄清胰活血颗粒的乙醇提取工艺，并通过正交设计法优选其最佳提取工艺。结果乙醇回流提取法与乙醇渗漉法提取的延胡索乙素含量较高，且含量相差不大，结合实践，采用乙醇渗漉法提取延胡索乙素，其最佳渗漉提取工艺为：浸泡36 h，乙醇浓度55%，乙醇用量10倍，渗漉流速3 ml·min-1。结论该工艺客观可行，稳定合理，可为工艺生产提供理论依据。

关键词：渗漉提取法；正交设计；高效液相色谱；延胡索乙素；柴黄清胰活血颗粒

中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）06-0074-03

【Abstract】Objective： To optimize the best ethanol extraction process of Chaihuang Qingyi Huoxue Granule. Methods： Ethanol reflux extraction， ethanol ultrasonic extraction and ethanol percolation extraction were used to extract part of medicinal materials from Chaihuang Qingyi Huoxue Granule and HPLC was used to determine content of tetrahydropalmatine. The highest content extraction of tetrahydropalmatine was taken as ethanol extraction technology of Chaihuang Qingyi Huoxue Granule， and its optimal extraction process was optimized by orthogonal design. Results： The ethanol reflux extraction and ethanol percolation extraction could extract higher amount of content with less different content. In practice， the ethanol percolation extraction was used to extract tetrahydropalmatine. The optimum extraction process was as follows： 36-hour soaking， 55% of ethanol concentration， 10 times of ethanol dosage， 3 ml·min-1 of percolation flow rate. Conclusion： The process is objective and feasible， stable and reasonable， which can provide a theoretical basis for its production.

【Key words】percolation extraction， orthogonal design， HPLC， tetrahydropalmatine， Chaihuang Qingyi Huoxue Granule

柴黄清胰活血颗粒是西南医科大学附属中医医院协定处方，主要由生大黄、柴胡、延胡索、丹参、栀子、黄芩、白芍等14味中药组成。具有清热解毒、活血消肿、通腑泻热、理气止痛的功效，用于急性胰腺炎的治疗。处方中延胡索所含有效成分延胡索乙素和丹参所含有效成分：丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮、异隐丹参酮等成分，易溶于醇、醚等有机溶剂[1～2]。现代药理研究证实，延胡索乙素具有镇痛抗炎作用，提高模型大鼠应激能力，提高小鼠抗疲劳能力及耐缺氧能力等作用[3]。为了最大限度地提取上述中药的有效成分，笔者考虑使用乙醇提取柴黄清胰活血颗粒的有效成分，采用70%乙醇回流提取、超声提取和渗漉提取上述中药材，用HPLC法测定其中指标性成分延胡索乙素的含量，选取延胡索乙素含量最高的提取方法作为柴黄清胰活血颗粒的乙醇提取工艺，并通过正交设计法优选其最佳提取工艺[4～5]。

1仪器与材料

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-20A紫外可见检测器LCsolution色谱工作站；UltimateTM C18键合硅胶柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；JPGT0328超声提取器（武汉嘉鹏电子有限公司），NRB17S3W电冰箱（日本松下）；HH数显电热恒温水浴箱（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；ZK072型电热真空干燥箱（上海实验仪器厂）；AUW120D电子天平（日本岛津）；延胡索乙素（购自中国药品生物制品检定所，批号110726-201516，供含量测定用）；延胡索（CORYDALIS RHIZOMA）、丹参（SALVIAE MILTIORRHIZAE RADIX ET RHIZOMA）均购于泸州市天植中药饮片公司，经泸州市药检所中药室袁常珍主任鉴定均符合《中国药典》2015年版相关要求；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果。

2.1色譜条件与系统适应性试验UltimateTM C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（三乙胺调PH值至6.4）（52：48），流速：1 mL·min-1，温度：25℃，波长：280 nm，进样量10 μL，在此条件下，延胡索乙素峰和供试品中其他相邻组分色谱峰的分离度较好，按延胡索乙素峰计算，理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3000[6～7]。

2.2对照品溶液的制备精密称取延胡索乙素对照品7.1 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声溶解并定容至刻度，摇匀，得对照品母液，再取上述溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得浓度为0.0355 mg·mL-1对照品溶液

2.3线性范围的考察分别精密吸取上述对照品溶液2.5、5、10、15、20 μL注入高效液相色谱仪，按拟定的色谱条件测定，将峰面积（Y）与质量浓度（X）进行线性回归，计算得到回归方程：Y=899714X+12003，R2=0.9998（n=5）表明对照品在0.0889～0.71 μg之间与峰面积线性关系良好，见图1-3。

2.4乙醇提取方法比较

2.4.1乙醇回流提取法取延胡索、丹参粉碎成粗颗粒（过10目筛），分别精密称取延胡索20 g，丹参30 g，置500 mL磨口烧瓶中，加热回流提取2次，每次加入70%的乙醇400 mL，浸泡30 min，提取1 h，过滤，合并滤液减压浓缩至少量，60 ℃恒温干燥，得粗提物。

2.4.2乙醇超声提取法取延胡索、丹参粉碎成粗颗粒（过10目筛），分别精密称取延胡索20 g，丹参30 g，置500 mL烧杯中，超声提取2次，每次加入70%的乙醇400 mL，浸泡30 min，提取1 h，过滤，合并滤液减压浓缩至少量，60 ℃恒温干燥，得粗提物。

2.4.3乙醇渗漉提取法取延胡索、丹参粉碎成粗颗粒（过10目筛），分别精密称取延胡索20 g，丹参30 g，取70%乙醇400 mL，先用适量的乙醇浸泡30 min，使其均匀润透，取脱脂棉一团，用浸泡液润湿后垫在渗漉筒底部铺平，装筒，将剩余的乙醇加入，加盖密闭24 h，以1 mL·min-1流速渗漉，收集完渗漉液，减压浓缩至少量，60 ℃恒温干燥，得干浸膏。

2.4.4准确称取上述3种干浸膏1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入溶剂（浓氨：甲醇=1：20）50 mL，称定重量，冷浸1 h，加热回流1 h，放至室温，称定重量，加甲醇补足损失重量，摇匀，滤过，即可得供试品溶液。各精密吸取10 μL，按2.1项下色谱条件进行测定，测定峰面积，计算胡索乙素含量。结果：乙醇回流提取法测得胡索乙素含量为0.8489 mg·g-1，乙醇超声提取法测得胡索乙素含量为0.5864 mg·g-1，乙醇渗漉法测得胡索乙素含量为0.8318 mg·g-1。通过比较，乙醇回流提取法和乙醇渗漉法提取的胡索乙素含量相差不大，考虑到丹参中的丹参酮ⅡA的热稳定性较差[8]，故采用渗漉法作为乙醇提取工艺。拟采用正交设计，优选乙醇渗漉法的最佳提取条件。

2.5乙醇渗漉工艺优选以乙醇浓度、浸泡时间、加醇量、渗漉流速四因素、三水平，采用L9（34）正交试验法安排实验，以干浸膏、胡索乙素含量为指标，优选乙醇渗漉工艺最佳条件。取延胡索、丹参粉碎成粗颗粒（过10目筛），准确称取9份样品，每份含延胡索20 g，丹参30 g。按表1中9种工艺条件组合进行渗漉提取，提取液减压浓缩至少量，60 ℃恒温干燥成干浸膏，备用。见表1。

2.6供试品溶液的制备 分别取9种试验后的干浸膏各0.5 g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入溶剂（浓氨：甲醇=1：20）50 ml，称定重量，冷浸1h，加热回流1h，放至室温，称定重量，加甲醇补足损失重量，摇匀，滤过，即可得供试品溶液。

2.7方法学考察

2.7.1精密度考查精密吸取延胡索乙素对照品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件连续进样5次，测定峰面积，RSD为1.01%，表明仪器精密度较高。

2.7.2稳定性试验精密吸取同一供试品溶液，分别于制备后0，2，4，6，8，10 h按2.1项下色谱条件进样，结果胡索乙素峰面积的RSD为0.62%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.7.3重复性试验取同一供试品溶液6份，分别按2.1项下色谱条件进行测定，结果胡索乙素峰面积的RSD为0.67%，表明方法重复性良好。

2.7.4加样回收试验取6份6号正交试验干浸膏0.5 g精密称定重量，精密加入对照品母液溶液（0.71 mg·mL-1）0.5 mL按2.6项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，计算胡索乙素峰的平均回收率，结果见表2。

2.8结果正交实验安排与结果见表3，结果方差分析见表3-4。

通过直观分析可知，各因素对乙醇渗漉提取工艺的影响顺序为A>B>D>C。方差分析表明，A因素对胡索乙素转移率影响显著，其他因素则无显著影响，结合生产实际考虑，确定其最佳提取工艺为A1B3C3D3，即加10倍量55%乙醇，浸泡36 h，以3 mL·min-1的速度渗漉。

2.9工艺验证按处方量称取药材3份，按选定的最佳提取工艺提取，即加10倍量55%乙醇，浸泡36 h，以3 mL·min-1的速度渗漉，按2.1项下色谱条件测定，结果胡索乙素转移率为：56.73%、57.21%、57.11%，表明该工艺稳定可行、重复性较好。

3讨论

本试验粗略地比较了3种不同的乙醇提取方法，其中乙醇加热回流提取工艺和乙醇渗漉工艺提取得到的胡索乙素含量最高。在大生产中，渗漉提取工艺既有较高的提取率，又能为生产企业节约生产成本，是一种理想的提取工艺。

本实验在选择流动相时使用缓冲盐溶液，分别对甲醇—缓冲盐系统及乙腈—缓冲盐系统进行色谱考察，甲醇—缓冲盐溶液系统对色谱柱的压力过高，容易对色谱柱造成损害，更对色谱图造成误差，因此不采用，使用乙腈—缓冲盐系统，色谱峰峰形较好，分离度较高[9～10]。

由于9个实验的出膏率不一样，采用干浸膏中胡索乙素的含量作为数据分析的依据，结果没有可比性，正交试验方差分析数据也不准确，所以本试验采用胡索乙素的转移率作为考察指标。

3.4本试验采用高效液相色谱法测定胡索乙素含量，分离效果好，操作简便，稳定性好，测定结果为优选柴黄清胰活血颗粒乙醇渗漉提取工艺提供参考依据。为柴黄清胰活血颗粒进一步开发利用提供实验依据。

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