CRISPR系统在染色体标记方面的应用

张淑贤

摘 要 在细胞分化和发育过程中，细胞核的结构也在不断的改变。哺乳动物基因组在细胞核内的装配不是随机的，且被认为与基因的调控有关，而且细胞核装配缺陷还会造成一些人类疾病的产生。但是基因定位与基因表达简单因果关系至今尚不明确，主要因为基因位置动态变化的分析依旧受限。随着CRISPR系统的出现，其在标记方面的应用价值逐渐显露出来。在CRISPR系统中，将Cas9蛋白替换为不具有切割能力的dCas9蛋白，将荧光蛋白与dCas9结合或与sgRNA的支架结构相结合，CRISPR系统便可用于染色体的标记。

关键词 CRISPR 染色体标记 Casilio系统 F+E修饰 多色标记

中图分类号：Q789 文献标识码：A

CRISPR-dCas9系统中，dCas9可以与荧光蛋白融合表达，sgRNA结合到特定基因位点后，荧光蛋白也被牵引到该处从而显示基因的位置。除此之外，sgRNA后连有一段支架序列，用于dCas9蛋白的附着，若对支架进行修饰也可以提供其他的蛋白结合位点，用于招募荧光蛋白。sgRNA与蛋白质相比对基因组DNA的亲和力更强，因此CRISPR可以作为一种简单且效率高的手段，应用于活细胞中各种基因组位点的动态标记观察中。传统的CRISPR系统存在sgRNA表达水平较低，且与Cas9结合效率不高的问题，严重限制的了CRISPR标记系统功能的发挥。为了改进这一缺点，多种修饰过的CRISPR标记系统应运而生。

1 Casilio系统

2016年，Haoyi Wang等学者提出了Casilio系统，该系统是将CRISPR-dCas9与Pumilio/fem–3-binding factor （PUF）相结合，即对sgRNA的支架结构进行修饰，将其改造成PUF蛋白的结合区域（PUF binding site， PBS），再由PUF蛋白实现对其他效应因子的招募 。效应因子包括转录激活因子，荧光蛋白等，因此该系统不仅可用于染色体标记，还可用于转录调控。PUF作为一种8序列重复蛋白由36个氨基酸组成，可以识别一段8nt的RNA序列。这种能与RNA结合的结构域相当保守，PUF的识别原则如下：半磅氨酸和谷氨酰胺结合腺嘌呤，天冬氨酸和谷氨酰胺结合尿嘧啶，丝氨酸和谷氨酰胺结合鸟嘌呤，精氨酸和丝氨酸结合胞嘧啶 。利用這种简单的配对原则，一种特殊8nt长的RNA序列（PUF binding site， PBS）被设计为sgRNA支架作为PUF的识别位点。PUF结构域与其他效应因子或蛋白标签融合，如绿色荧光蛋白，可用于染色体标记。

2 F +E CRISPR-dCas9系统

2014年Baohui Chen等学者在将CRISPR系统应用于染色体标记时发现，单纯的将Cas9蛋白替换成dCas9蛋白时，用于标记癌细胞的端粒时，每个细胞中只能看到10-40个亮点，远远少于细胞的端粒数。鉴于传统的sgRNA结构存在稳定性差的原因，研究者对sgRNA的支架进行了修饰，sgRNA Pol-III茎环结构中连续的4个尿嘧啶碱基可能形成终止子， 造成U6 Pol-III转录过早的被终止，影响sgRNA结构的形成，因此利用碱基互补配对的方法，将第四个尿嘧啶碱基替换成腺嘌呤，得到sgRNA F，为了提高sgRNA与dCas9结合的稳定性，新增5对互补碱基对延长了sgRNA支架上发卡结构，得到sgRNA E。改变后结合在一起构成F+E CRISPR-dCas9系统，F+E的改变使sgRNA更加稳定的同时增强了其对Cas9蛋白的聚集作用。dCas9蛋白与荧光蛋白融合后便可应用于染色体标记 。

3多色标记系统

CRISPR-dCas9除了能应用于单色标记之外，还能应用于多色标记。为了实现多色标记，2015年Hanhui Ma等学者使用了三种不同来源的Cas9蛋白，即来自S. pyogenes的sp Cas9，来自 Neisseria meningitidis的Nm Cas9和来自Streptococcus thermophilus 的St1 Cas9，并将三者同时导入细胞中对基因进行标记 。这三种蛋白各自拥有自身与sgRNA的结合位点，互不冲突。这种CRISPR标记系统是将三种Cas9蛋白通过氨基酸突变的方式转变成dCas9蛋白，然后分别融合不同颜色的荧光蛋白，即绿色荧光（GFP），蓝色荧光（BFP）和红色荧光（RFP），然后在其序列前添加相同或不同的sgRNA序列，构建成一个完整的系统。三种融合不同荧光的Cas9蛋白在同一质粒中表达，若sgRNA相同，则同一位点就能被三种颜色所显示，若三种dCas9蛋白分别对应不同的sgRNA，则不同的位点显示不同的颜色，从而达到多色标记的效果。除上述使用不同的Cas9蛋白进行三色标记系统外，还有一种CRISPR系统仅凭一种spCas9便可实现双色标记。2016年，Siyuan Wang等学者采用对sgRNA进行修饰的方法，即在sgRNA支架上分别添加供MS2外壳蛋白（MCP）结合的MS2寡核苷酸适配子和与PP7外壳蛋白（PCP） 结合的PP7寡核苷酸适配子，两种蛋白分别融合表达不同的荧光，使得该系统在只使用一种spCas9的前提下同时表达两种荧光 。这种策略曾用于在同一细胞中招募不同功能的分子化合物以区分不同的基因组位置。若将两种sgRNA支架的修饰方法融合应用于同一sgRNA中或两种支架使用同种sgRNA时，则同一位点就能被两种颜色所显示，若两者支架不在同一系统中，且分别对应不同的sgRNA，则不同的位点显示不同的颜色。

参考文献

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