肉杂鸡肺炎克雷伯菌耐药菌株的分离鉴定

司振书++张海涛++邵丹++秦飞燕

摘要：2015年6月中旬，山东省莘县、高唐等地多个养殖场3日龄肉杂鸡出现张口、伸颈、呼吸困难等症状，剖检呼吸道无明显病变，心脏、肝脏周围及皮下有大量淡黄色胶冻样渗出物，肝脏有大量点状坏死，为确定病原，对发病鸡的喉拭子进行了流感抗原性检测；对病鸡的肺脏进行了病毒分离培养；对其肝脏、心脏进行了细菌的分离培养、生化鉴定及药敏试验。结果表明，肉杂鸡发病由金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的混合感染所致，针对无禽流感病毒和新城疫病毒的感染，采取了敏感药物治疗、消毒、加强饲养管理等综合措施，7 d后，发病情况逐渐好转，鸡群15日龄时趋于稳定。

关键词：肉杂鸡；肺炎克雷伯菌；金黄色葡萄球菌；分离鉴定；耐药菌株

中图分类号： S858.31文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0152-02

鲁西小型肉杂鸡是用快大型白羽肉鸡的父母代父系公鸡作父本，褐壳商品蛋鸡作母本杂交而来，具有生长速度快、饲料报酬高、饲养周期短、料肉比低、肉质嫩、易加工、易成熟等特点，是制作脱骨扒鸡的最理想原料，在山东聊城各县（区）均具有较大养殖规模。2015年6月中旬，山东省莘县、高唐等地多个肉杂鸡养殖场相继发生同样疾病，3日龄小肉鸡开始出现张口、伸颈、呼吸困难，生长发育受阻，剖检呼吸道无明显病变，心脏、肝脏周围及皮下有大量的淡黄色胶冻样渗出物，肝脏有大量点状坏死。通过对鸡苗来源与去向等调查排除了鸡苗质量问题。采取病料进行细菌的分离培养，经鉴定分离到1株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和1株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），且肺炎克雷伯菌分离株对多种药物具有耐药性。

1材料与方法

1.1材料与设备

营养琼脂平板、高盐甘露醇琼脂平板、麦康凯琼脂平板由聊城大学动物预防兽医实验室制备。禽流感病毒（通用）抗原快速检测卡，购于深圳真瑞生物科技有限公司；XK型自动细菌鉴定仪、肠杆菌鉴定试剂盒、葡萄球菌鉴定试剂盒等由山东鑫科生物科技有限公司提供；各种药敏纸片，购于浙江杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2病料的采取

进行无菌操作，取发病肉鸡的喉拭子、肺脏、肝脏、心脏。

1.3禽流感抗原检测

将喉拭子立即用禽流感病毒抗原快速检测卡进行检测，操作方法按说明书进行。

1.4病毒的分离培养与鉴定

进行无菌操作，取少量肺脏样品，放入灭菌的研磨器，加含双抗的PBS研磨成10%～20%的悬液。4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min，取上清，接种于4 枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔，02 mL/胚，每12 h照胚1 次，弃去24 h内死亡胚，及时取出24～72 h死胚，于4 ℃冰箱过夜，72 h未死亡的全部取出置于冰箱内冻死，无菌收取尿囊液。用1%的鸡红细胞测定尿囊液有无血凝性；若无血凝性，则可排除新城疫病毒、禽流感病毒的感染；若有，则通过血凝抑制试验进一步进行鉴定。

1.5细菌的分离培养

取肝脏、心脏分别接种营养琼脂平板、高盐甘露醇琼脂、麦康凯琼脂平板，37 ℃恒温培养24 h，观察结果，挑取单个菌落进行纯培养。

1.6细菌的形态染色观察

将分离得到的细菌纯培养物进行革兰氏染色，镜检观察。

1.7细菌的鉴定

将分离纯化的细菌分别采用适宜的细菌鉴定试剂盒，通过XK型自动细菌鉴定仪进行鉴定，操作方法按说明书进行。

1.8药敏试验

挑取分离纯化的细菌菌落，用灭菌的生理盐水制成悬液，校正浓度为0.5 麦氏标准，用灭菌棉签均匀涂布平板，贴上各种药敏纸片，置于37 ℃恒温箱培养，18 h后取出测量抑菌圈直径。

2结果与分析

2.1禽流感病毒抗原检测结果

经检测，病鸡喉拭子禽流感病毒抗原为阴性。

2.2病毒分离结果

接种病料的4 枚SPF鸡胚孵化72 h均未死亡，对尿囊液进行HA检测，均无血凝性。

2.3细菌的分离培养结果

从肝脏分离得到的细菌在营养琼脂平板上形成光滑、隆起、圆整的橙黄色菌落；在高盐甘露醇琼脂上，形成淡黄色、光滑、湿润、圆形的小菌落；在麦康凯琼脂上不生长。从心脏分离得到的细菌，在营養琼脂平板上形成光滑、湿润、乳白色、凸起、浓厚黏稠的菌落；在麦康凯琼脂平板上，菌落淡红色，黏稠、胶状；在高盐甘露醇琼脂上不生长。对分离得到的细菌进一步纯化，最后获得2 种细菌的纯培养物。

2.4细菌形态染色特点

从肝脏分离到的细菌呈球形，革兰氏染色呈阳性，多呈葡萄串状，也有成对或短链状排列的；从心脏分离到的细菌呈杆形，革兰氏染色呈阴性，多单个存在。

2.5分离菌的鉴定结果

将分离得到的革兰氏阴性杆菌用肠杆菌鉴定试剂盒进行检测，各生化孔显示，蕈糖+、蔗糖+、赖氨酸脱羧酶+、乳糖+、尿素酶+、靛基质试验-、七叶苷+、丙二酸盐+、鸟氨酸脱羧酶-、山梨醇+、OF+、水杨素+、枸橼酸盐-、肌醇+、精氨酸-、棉子糖+、β半乳糖+、甘露醇+，鉴定结果表明该菌为肺炎克雷伯菌，鉴定概率为99.99%。将分离到的革兰氏阳性球菌用葡萄球菌鉴定试剂盒进行检测，各生化孔显示，乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、甘露糖、蕈糖、果糖等均为+，硝酸盐-、鸟氨酸脱羧酶-、水杨苷-、纤维二糖-、β半乳糖-、精氨酸+、尿素酶试验+、溶血+、棉子糖-、七叶苷-，鉴定结果表明该菌为金黄色葡萄球菌，鉴定概率为9999%。

2.6药敏试验结果

分离得到的肺炎克雷伯菌敏感药及抑菌圈直径分别为米诺环素23 mm、头孢他啶18 mm，而对头孢噻吩、头孢呋辛、呋喃妥因、头孢吡肟、万古霉素、青霉素G、四环素、克林霉素等均耐药；分离到的金黄色葡萄球菌的敏感药及抑菌圈直径分别为头孢呋辛25 mm、丁胺卡那霉素24 mm、庆大霉素 22 mm、头孢氨苄 21 mm、卡那霉素21 mm、环丙沙星20 mm，而对四环素、复方新诺明、克林霉素等耐药。

3讨论

病鸡喉拭子禽流感病毒抗原检测为阴性，可初步排除禽流感病毒的感染，SPF鸡胚进行病毒的分离培养，收获的尿囊液无血凝性，说明发病鸡群无禽流感病毒、新城疫病毒的感染；从病鸡肝脏及心脏分离到2 种细菌纯培养物，根据其形态特征、培养特性及生化特点判断，两者分别为金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。据此可初步判断，该发病由肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌混合感染所致。

肺炎克雷伯菌广泛存在于自然界，也存在于动物的肠道、呼吸道和泌尿道中，为条件性致病菌[1]。当机体免疫力低下或长期使用抗生素时，引发人和动物的多种疾病。荣光等从发病濒死的五指山猪体内分离到肺炎克雷伯菌肺炎亚种[2]；刘燕等从白颊长臂猿的脓液中分离到肺炎克雷伯菌肺炎亚种，该菌感染导致白颊长臂猿的脓肿、死亡[3]。肺炎克雷伯菌可引起人的肺炎、败血症、脑膜炎、肝脓肿等，在家禽，能引起死胚、卵黄囊感染、呼吸道病、眼病、败血症和繁殖性疾病[1]。本次肉杂鸡的发病可能由于养殖场饲养管理水平较差，日常消毒等环境控制措施不到位，给金黄色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌以可乘之机，造成严重的经济损失。

肺炎克雷伯菌感染家禽的病例报道较少，而对人感染的报道及研究较多。李振江等对256个肺炎克雷伯菌临床分离株进行了耐药性研究，结果表明该菌对抗菌药物的耐药性较高，49.0%的产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的菌株呈多重耐药[4]。本次从肉杂鸡分离到的肺炎克雷伯菌，除对米诺环素、头孢他啶具有一定的敏感性外，对其他多种药物均耐药，呈现强的耐药性，兽医临床应重视该菌的感染及流行情况，合理使用抗菌药物。翁幸鐾等对1株耐药肺炎克雷伯菌的耐药相关基因进行研究，该菌株对哌拉西林、氨苄西林、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星等均耐药，该菌耐药与其携带获得性耐药基因TEM-1、SHV-11、aac（3）-Ⅱ等基因相关[5]。本次分离到的金黄色葡萄球菌则对多种药物敏感，综合2种病原菌的药敏试验结果，选用头孢他啶进行治疗，同时对所用器皿、工具、笼舍进行全面消毒，7 d后，发病情况逐渐好转，15日龄时鸡群趋于稳定。

参考文献：

[1]中國农业科学院哈尔滨兽医研究所.兽医微生物学[M]. 2版.北京：中国农业出版社，2013：179-181.

[2]荣光，赵军明，侯冠彧，等. 五指山猪肺炎克雷伯菌肺炎亚种的分离及鉴定[J]. 西北农业学报，2011，20（10）：1-5.

[3]刘燕，赵京，张成林，等. 肺炎克雷伯氏菌致白颊长臂猿脓肿一例[J]. 野生动物，2011，32（3）：156-157.

[4]李振江，孙长贵，曾贤铭，等. 肺炎克雷伯菌医院感染监测及耐药性分析[J]. 中华医院感染学杂志，2007，17（6）：737-739.

[5]翁幸鐾，糜祖煌. 多耐药肺炎克雷伯菌获得性耐药基因及ompK36突变研究[J]. 中华医院感染学杂志，2010，20（17）：2545-2548.