生物制品中牛病毒性腹泻病毒RT—PCR及套式 RT—PCR检测方法的建立及应用

顾蓓蓓++王妍鳕++李双洁++卢劲晔++苗晋锋

摘要：为建立生物制品中牛病毒性腹泻病毒（BVDV）污染的检测方法，根据GenBank公布的BVDV序列，分别设计了普通PCR和套式PCR的特异性引物，建立了检测BVDV的普通PCR和套式PCR检测方法。结果表明，该方法可以快速检测出生物制品中的BVDV污染，为生物制品中BVDV的快速、低含量检测提供了简单快速的检测方法。

关键词：牛血清；疫苗；牛病毒性腹泻病毒；套式RT-PCR

中图分类号： R914；S858.235.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0030-03

牛病毒性腹泻/黏膜病（bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染引起的，以发热、白细胞减少、胃肠道黏膜糜烂溃疡、腹泻及怀孕母牛不孕、流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病[1]。牛病毒性腹泻呈世界性分布，在养牛发达国家也广泛存在，给畜牧业带来了重大的经济损失。BVDV属于黄病毒科瘟病毒属，与猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）同属，具有抗原相关性，猪也可感染BVDV，感染后症状和病理变化与猪瘟类似，此病引起许多国家的关注，尤其是猪瘟已经被消灭或控制的国家和地区。

近年来，国内研究人员多次从发病猪群中分离到BVDV，证实了该病在我国一直存在。一般认为猪感染BVDV的传染源为污染了BVDV的猪瘟活疫苗。据调查，我国猪瘟疫苗质量控制问题突出，BVDV污染严重。中国兽医药品监察所对国内不同厂家生产的不同批次猪瘟疫苗半成品及成品检测结果显示，两者的BVDV阳性率分别达20.7%、22.2%。疫苗生产中感染牛病毒性腹泻病毒是因为在细胞培养时使用了被BVDV污染的犊牛血清造成的，而这种感染又不易被发现，使用这种感染的血清用于生产疫苗的细胞受到污染，损失巨大[2-3]。近年来，多地检验检疫部门在进口牛血清中检测出BVDV。目前针对牛血清及疫苗中BVDV的检测标准缺失，因此建立特异性的BVDV检测方法至关重要。本研究根据GenBank公布的BVDV序列，分别设计了普通PCR和套式PCR的特异性引物，建立了检测BVDV的普通PCR和套式PCR检测方法，以期为牛病毒性腹泻/黏膜病的临床快速诊断提供理论依据。

1材料与方法

1.1主要试剂及仪器

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、猪瘟病毒（CSFV）、牛肾细胞MDBK、传染性牛鼻气管炎病毒由笔者所在实验室保存。TRIzol购自Invitrogen公司，Takara PCR Mix、凝胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

主要仪器：SmartSpecTM Plus核酸浓度测定仪、梯度PCR仪、GelDoc XR凝胶成像系统（Bio-Rad）、台式高速低温离心机（eppendorph）。

1.2病毒基因组RNA的提取

将BVDV接种于MDBK单层细胞，设空白对照，待细胞出现典型的空泡病变后，收获病毒，用Trizol试剂盒提取病毒基因组及对照细胞的RNA。

1.3RT-PCR反应

1.3.1RT-PCR反应根据已发表的BVDV标准毒株的全序列，设计合成引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：WS-BVDV-F：5′-CTT AGC GAA GGC CGA AAA GAG-3′；WS-BVDV-R：5′-CTC CAT GTG CCA TGT ACA GCA G-3′。

用随机引物同时对样品进行反转录，建立样品的cDNA。PCR扩增反应体系：Takara PCR Mix 12.5 μL，cDNA 2 μL，10 μmol/L 上游、下游引物各1 μL，加水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min，扩增反应条带为312 bp。

1.3.2套式RT-PCR反应根据已发表的BVDV标准毒株的全序列，选择BVDV保守性较强的5′非编码区域，设计合成2对特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：BVDV-1 F：5′-TCAGCGAAGGCCGAAAAGAGG-3′；BVDV-1 R：5′-TCCATGTGCCATGTACAGCAGAG-3′；BVDV-1 Fn：5′-CAGTGGCGAGTTCGTTGGATG-3′；BVDV-1 Rn：5′-GGCCTCTGCAGCATCCTATCAG-3′。

用随机引物同时对样品进行反转录，建立样品的cDNA。第1轮PCR扩增反应体系：TaKaRa PCR Mix 12.5 μL，cDNA 2 μL，上游、下游引物BVDV-1F、BVDV-1R（10 μmol/L）各1 μL，加水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min，扩增反应条带为309 bp。

第2轮PCR扩增反应模板为第1轮PCR产物，反应体系：TaKaRa PCR Mix 12.5 μL，第1轮PCR扩增反应产物 1 μL，20 μmol/L上游、下游引物各1 μL，加水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min，扩增反应条带为197 bp。

1.4PCR特異性试验

分别提取BVDV、CSFV、传染性牛鼻气管炎病毒、MDBK 正常细胞的RNA，用已建立的2种方法进行扩增，验证所建方法的特异性。

1.5检测方法的初步应用

利用所建的套式RT-PCR方法检测血清、疫苗等生物制品，同时对阳性扩增产物进行测序鉴定，进行序列分析。

2结果与分析

2.1扩增产物检测

PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，普通PCR扩增产物位于312 bp，套式PCR第1轮扩增产物位于309 bp（图1），第2轮扩增产物在197 bp处可见特异性DNA扩增条带，与预期大小相符（图2）。

2.2特异性试验

利用设计的普通PCR引物对牛病毒性腹泻病毒进行扩增，扩增产物位于312 bp，猪瘟病毒、MDBK细胞、牛传染性鼻气管炎病毒均未扩增出片段（图3）。利用设计的套式PCR第1轮引物对牛病毒性腹泻病毒扩增除了309 bp的目的基因片段，测序结果与BVDV毒株序列一致，而猪瘟病毒、MDBK 细胞、牛传染性鼻气管炎病毒均未能扩增出片段（图4）。取第1轮PCR产物各1 μL为模板，利用第2轮引物进行扩增，在位于197 bp处可见特异性DNA扩增条带，与预期大小相符，测序鉴定结果与BVDV序列一致，而猪瘟病毒、MDBK细胞、牛传染性鼻气管炎病毒均未扩增出片段（图5）。

2.3检测方法的应用

应用本研究建立的BVDV普通RT-PCR和套式 RT-PCR 检测方法，检测来自不同批次的牛血清和疫苗制品各6份，共计12份样品，检测结果表明，本研究建立的方法能够检测出生物制品中污染BVDV的情况，且套式PCR的检测结果更为灵敏、准确（图6、图7）。

3结论与讨论

小牛血清是生物制品制造过程中不可或缺的原材料，其安全性备受关注。研究表明，细胞培养的生物制品中BVDV

核酸物质污染基本上是由于使用了含有BVDV核酸物质的牛血清引起的。因此在使用牛血清前，尤其是在用于制造人或动物疫苗等生物制品时，应严格检测其是否被BVDV污染[4]。《欧盟生物制品生产牛血清使用指南》要求用细胞培养法和免疫荧光抗体法确认牛血清病毒的感染性[5]。《中国药典》三部附录也对新生牛血清检测提出了相同的技术要求。虽然各国对于牛血清的生产均有严格的技术规范，但由于检测技术存在局限性，市场上还是有部分牛血清存在BVDV污染现象[6]。近2年，我国2次在进口小牛血清中检测到BVDV，发布了2次风险预警，先后禁止新西兰、澳大利亚的相关产品入境。由于BVDV和CSFV存在抗原交叉性，带有BVDV抗原的血清不能用来培养CSFV，而应用BVDV

污染的猪瘟疫苗免疫猪只可能导致其感染BVDV，引起类似于非典型猪瘟的发生。因此科研单位和生物制品企业应该加强对其使用的小牛血清的BVDV检测。

目前，BVDV的检测方法有病毒分离技术、免疫荧光技术、病毒中和试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等[7]。与病毒分离技术、病毒中和试验等方法相比，RT-PCR技术具有快速高效且特异性强等特点。本研究建立了BVDV的RT-PCR检测方法，同时根据BVDV 5′端非编码区设计2对引物，建立了比常规PCR灵敏度更高的套式RT-PCR方法，为生物制品中微量的BVDV污染提供了一种更加特异、敏感的方法。本方法临床应用结果显示，在随机抽检的疫苗和血清样品中均能检测到被BVDV污染的样品，且套式PCR的检测灵敏度优于普通PCR，表明上述2种方法均能用于检测生物制品中BVDV污染。

参考文献：

[1]祖立闯，王金良，李娇，等. 牛病毒性腹泻病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中国兽医学报，2010，30（12）：1598-1601，1605.

[2]Peterhans E，Bachofen C，Stalder H，et al. Cytopathic bovine viral diarrhea viruses （BVDV）：emerging pestiviruses doomed to extinction[J]. Veterinary Research，2010，41（6）：44.

[3]陶洁，廖金虎，张倩，等. 猪感染牛病毒性腹泻病毒研究进展[J]. 中国预防兽医学报，2014，36（5）：410-413.

[4]祖立闯，魏凤，苗立中，等. 应用套式RT-PCR检测猪瘟制品中牛病毒性腹泻病毒污染的研究[J]. 养猪，2011（6）：97-100.

[5]The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. Note for guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal product（CPMP/BWP/1793/02） [M]. London：EMEA，2003：5-7.

[6]王竞晗，李素，何文瑞，等. 进口胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒的分离及鉴定[J]. 中国生物制品学杂志，2016，29（3）：308-311.

[7]張宁，秦建华，赵博伟，等. 牛病毒性腹泻-黏膜病诊断方法研究进展[J]. 动物医学进展，2008，29（2）：93-97.