校园植物凋落叶浸提液对土壤中自身固氮菌生长的影响

马小明+拦生发+张玮+李慧+魏学涛

摘 要 采集三种校园植物凋落叶并制备浸提液，按比例配成混合液，处理土壤，然后通过平板涂布法在选择培养基上培养、筛选并统计自生固氮菌菌落数，从而反映不同植物凋落叶浸提液及不同组合浸提液对自生固氮菌生长的影响。得出不同叶片浸提液组合后促进固氮菌生长的效果好于单一叶片浸提液的作用，且种类越多促进作用越明显。鉴于此，建议学校在绿化建设不影响美观情况，选择多种植物混合搭配种植。

关键词 植物凋落叶 浸提液 自身固氮菌 校园绿化

中图分类号 Q-33 文献标志码 B

1 实验背景

“绿化”是近些年新校园建设中很重要的一个项目。笔者所任教的学校在新校区的建设中为了秉承校园文化精神，提升校园文化品位，打造甘肃最美校园，建设了多个花坛。但花坛中种植的植物品种单一，主要以紫叶小檗和小叶女贞为主，穿插月季，但长势不佳。新校区土质不肥，若过一两年叶落归根，土质得到改善可以，到时植物长势会更好。因为叶片中的有机质经微生物分解为无机物，根系可以吸收再利用，同时也滋养了微生物群的发展壮大，使土壤更加肥沃。鉴于此，结合生物选修教材中“验证细菌分布的广泛性”“学习微生物培养基本技术”“某种微生物数量的测定”以及“微生物在其他方面的应用”，展开植物叶片浸出液对土壤微生物影响的研究。但土壤中微生物种类繁多、数量庞大，分离鉴定工作难以完成，所以只研究自身固氮菌。

2 实验目的

初步研究小叶女贞、紫叶小檗、月季三种凋落叶浸提液对自生固氮菌生长的影响；

初步学会微生物培养、分离、鉴定技术；

通过开展此实验，使所学的书本知识在生物科技活动中得以应用；

通过实验结果及结论，对校园绿化建设提供可行性建议。

3 实验原理

不同植物的凋落叶所含成分有所不同，对微生物生长的影响可能不同。自身固氮菌可以从空气中吸收氮气，并将其转化为氨加以利用。固氮原理为：N2+8H++16Mg-ATP+16H2O+8e-→2NH3+H2+16Mg-ADP+16Pi。该反应在固氮酶参与下完成。所以，利用植物自身固氮菌可以固氮的特性，采用无氮源的人工合成培养基（阿须贝培养基）培养和筛选出自生固氮菌，测定菌落数目变化，分析不同植物凋落叶浸提液对自生固氮菌生长、繁殖的影响。

4 实验材料及用具

材料：三种植物凋落叶（小叶女贞、紫叶小檗、月季）、校园花坛内土壤。

器具：无菌室及超净工作台（临夏州农科院蚕豆中心提供）、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱、酒精灯、烧杯、三脚架、石棉网、量筒、天平、电子天平、铁架台、玻璃棒、漏斗、放大镜、培养皿、试管、吸管、锥形瓶、涂布棒、土壤筛、烘干箱等。

耗材：标签纸、纱布、牛皮纸、记号笔、棉花、报纸等。

固氮菌分离培养基（阿须贝培养基）配方：葡萄糖10 g；NaCl 0.2 g；KH2PO4 0.2 g；CaSO4·2H2O 0.1 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCO3 5 g；琼脂 20g；水1 000 mL；pH7.0。

5 实验步骤

5.1 校园小叶女贞、紫叶小檗、月季等植物落叶浸提液制备

（1） 分别收集三种植物落叶，风干，用蒸馏水冲洗去除叶片表面尘土污渍，用酒精进行叶片表面消毒；

（2） 按照表1将不同叶片放入洁净锥形瓶，用蒸馏水浸泡72 h，得到3种凋落葉浸提液原液。

（3） 用细菌过滤器过滤浸提液原液，既不破坏生长因子、又防止杂菌污染。

（4） 将3种浸提液按表2中比例制备系列浸提液样液。

以上（1）～（4）步骤均在无菌室中完成。

5.2 土壤获取及处理

（1） 取土壤，除去表层落叶及其他杂物，采集5～10 cm深处的土样，装入塑料袋中，并标注采集的地点、时间等。为了防止土壤中微生物数量和种类发生变化，把土样暂放在冰箱中保存。

（2） 过1 mm土壤筛，称取30 g土壤，用烘干法计算土壤湿度。土壤湿度（重量%）=（原土重-烘干土重）/烘干土重×100%=（30.00 g-23.78 g）/23.78 g×100%=26.16%。

（3） 称取土壤8份，每份20 g，分别置于培养皿（标号依次为A～H）中，分别用A～H浸出液样液喷洒处理（5 mL/10 g）。在相同条件下，培养已处理土壤2 d。

（4） 分别取已处理的3 g土壤，置于锥形瓶，加蒸馏水200 mL，充分搅拌，得菌悬液8份（标号依次为A～H）。将每份菌悬液均依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍，备用（注意做好标记）。

5.3 倒平板

（1） 按照培养基配方配置培养基，用高压蒸汽灭菌锅在120℃条件下灭菌20 min。

（2） 倒平板。每个培养皿倒培养基15 mL左右，室温放置至其凝固。

5.4 平板涂布并培养

（1） 选取细菌悬液10-4、10-5、10-6倍的稀释液。

（2） 用注射器吸取稀释液0.2 mL，注入平板上，涂布棒快速涂布均匀。培养皿倒置（注意做好标记）；每种稀释液做3个重复。

（3） 留下3个培养皿做空白对照（以反映培养基是否被污染）。

（4） 所有培养皿置于35℃恒温箱保温培养，48 h后观察计数。

6 实验结果

观察各稀释度下培养皿中菌落生长状况，发现在10-5、10-6稀释度时，培养皿中菌落数太少，甚至没有菌落形成，故选择10-4稀释度下的培养基作为计数样本，统计数据见表3。

利用表3中平均值计算每毫升菌悬液原液中自身固氮菌数量，并绘制成柱状图，结果如图1所示。

计算公式为：每毫升菌悬液原液中细菌数量=平均值×104×5。

7 实验结论及建议

由以上结果可以得出：（1） 不同凋落叶浸出液对自身固氮菌生长都具有促进作用，但促进作用不同，C组促进作用最大，B组最小。（2） 不同凋落叶浸出液组合后促进作用较单一落叶浸出液促进作用明显，且叶片种类越多促进作用越明显，G组的促进作用>E组/F组/D组。

鉴于以上结论，建议选择校园绿化植物时，种类不能太单一，在保证美观基础上，应尽可能选用多种植物合理混搭种植。这样有利于一些土壤微生物的生长，而土壤微生物的生长又可改善土质，反过来为植物的生长提供更好的环境，使其进入良性循环。

参考文献：

[1] 韩斌，孔继君，邹晓明，巩合德.生物固氮研究现状及展望[J].山西农业科学，2009.（10）：86-89.

[2] 吴翔，甘炳成，贾定洪，蒋元继，唐杰.一株自生固氮细菌的分离和鉴定[J].西南农业学报，2013，26（1）：255-258.