姜黄素与卡铂联合用药对鼠卵巢癌转基因细胞系的影响

高英卓，孔令婷，齐亚飞，王劲欧，曹程程，吕庆杰

姜黄素与卡铂联合用药对鼠卵巢癌转基因细胞系的影响

高英卓，孔令婷，齐亚飞，王劲欧，曹程程，吕庆杰*

目的 探讨姜黄素与卡铂联合用药对鼠卵巢癌转基因细胞系T1、T2、T3的影响。方法 采用MTT法检测卡铂、姜黄素单独及联合用药对鼠卵巢癌转基因细胞系增殖的影响，RT-PCR及Western blot检测各组细胞中K-RAS、PI3K、AKT的表达水平。结果 通过MTT法检测细胞增殖抑制率，各浓度卡铂单独作用于鼠卵巢癌转基因细胞系T1、T2、T3的增殖抑制率<30%，与姜黄素联用后，增殖抑制率均>30% (P<0.05)，对转染了AKT的T2、T3作用更明显。联合组T1、T2、T3细胞的K-RAS、PI3K (p-PI3K)、AKT (p-AKT)的mRNA及蛋白表达量低于卡铂单用组。结论 鼠卵巢癌转基因细胞系T1、T2、T3对卡铂具有耐药性。姜黄素可逆转其对卡铂的耐药性，且对含有AKT的T2、T3作用更加明显。姜黄素的逆转作用可能与抑制K-RAS、PI3K、AKT的表达有关，其也可能直接抑制PI3K/AKT信号通路。

姜黄素；卡铂；卵巢癌

0 引言

卵巢癌的死亡率在女性生殖系统恶性肿瘤中居首位[1]。姜黄素(Curcumin，Cur)是从中药姜黄中提取的一种相对分子质量小的脂溶性多酚类色素，具有抗炎、抗氧化、抗癌、清除自由基、抗微生物等多方面药理作用[2]，美国国立肿瘤所已将其列为第3代癌化学预防药物[3]。卡铂(Carboplatin，Cap)是一种抗癌谱广、抗癌作用强、与多种抗癌药具有协同作用的第2代铂络合物[4-7]，现已广泛应用于临床。

本实验通过观察姜黄素与卡铂单独或联合用药对鼠卵巢癌转基因细胞系的影响，探讨姜黄素对鼠卵巢癌细胞系的抑制作用机制与K-RAS及其下游的PI3K/AKT信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与耗材 姜黄素(美国Sigma公司)，卡铂注射液(波贝，齐鲁制药有限公司)，二苯基四氮硅溴(MTT，华美生物工程公司)，二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)，K-RAS、p-PI3K、p-AKT抗体(博奥森公司)，β-actin(Santa Cruz公司)，辣根过氧化物酶标抗羊/兔IgG抗体(二抗，北京中山生物技术有限公司)，细胞培养板与培养瓶(Corning)。

1.1.2 仪器 CO2孵箱(Heraues)，低温高速离心机(Sigma)，倒置相差显微镜(OLYMPUS)。

1.1.3 细胞株 本研究应用具有明确基因型的卵巢癌细胞系T1、T2、T3，该体系以逆转录病毒为载体，将一系列确定可引起遗传突变的癌基因(c-myc、K-RAS、AKT基因)转染到p53基因敲除的雌性成年大鼠的卵巢表面上皮细胞内。大鼠卵巢癌细胞系的生成如下：C1(基因型：p53-/-，c-myc，K-RAS)，C2(基因型：p53-/-，c-myc，AKT)，C3(基因型：p53-/-，K-RAS，AKT)。由C1、C2、C3来源的肿瘤结节分离后，进行体外培养，形成鼠卵巢癌转基因细胞系T1、T2、T3。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 鼠卵巢癌转基因细胞系T1、T2、T3用含10%胎牛血清DMEM高糖培养基，在37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养，常规方法消化传代，取对数生长期细胞进行实验。分组：对照组为空白组；实验组为卡铂单用组，浓度为1、2、4、8 μg/mL；卡铂姜黄素联用组，即各浓度卡铂与20 μmol/L姜黄素联用。

1.2.2 MTT比色分析法检测细胞增殖抑制率 分别检测卡铂单用及卡铂与姜黄素联合作用于T1、T2、T3的细胞增殖抑制率，方法参照MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书，以上实验重复3次。平均生长抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%，其值<30%为耐药。

1.2.3 实时定量PCR法检测细胞K-RAS、PI3K、AKT的mRNA表达量 Trizol法抽提总RNA，样品-80 ℃保存，利用紫外分光光度计检测RNA样品浓度和纯度，逆转录合成cDNA，PCR扩增，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot检测K-RAS、p-PI3K、p-AKT蛋白表达 取对数生长期的T1、T2、T3细胞，卡铂单用或卡铂姜黄素联合作用24 h后，回收细胞，用细胞裂解液提取细胞总蛋白，于10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，参照Western blot常规方法，ECL试剂盒显影并成像。每组重复3次。以Bioimagining System灰度测量系统测量Wb条带灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件对所有数据进行统计分析，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测T1、T2、T3细胞增殖抑制率 各浓度卡铂(1、2、4、8 μg/mL)单独作用于T1、T2、T3细胞的增殖抑制率均<30%，表明鼠卵巢癌转基因细胞系T1、T2、T3对卡铂具有耐药性；单用姜黄素20 μmol/L作用于3种细胞的增殖抑制率<30%。当各浓度卡铂与姜黄素20 μmol/L联用时，细胞增殖抑制率升高。结果表明，姜黄素逆转了T1、T2、T3对卡铂的耐药性。当药物浓度为CBP 1+Cur 20时，T1细胞(33.11%)与T3细胞(70.92%)比较差异有统计学意义(P<0.05)；CBP 4+Cur 20时，T1细胞(43.71%)与T2细胞(88.01%)比较差异有统计学意义(P<0.05)；CBP 8+Cur 20时，T1细胞(50.26%)与T3细胞(90.5%)比较差异有统计学意义(P<0.05)。卡铂与姜黄素联用时，T2和T3的细胞增殖抑制率高于T1细胞。见图1。

图1 MTT法检测T1、T2、T3细胞增殖抑制率

注：CG：空白对照组；C1：卡铂浓度1 μg/mL，以此类推；Cur：姜黄素浓度均为20 μmol/L。同种细胞卡铂姜黄素联用组与同浓度卡铂单用组比较，*P<0.05，**P<0.01；卡铂姜黄素联用时，同样药物浓度，不同细胞间比较，△P<0.05

2.2 RT-PCR检测K-RAS、PI3K、AKT的mRNA表达水平 相应试剂作用24 h后，各组T1、T2、T3细胞K-RAS、PI3K及AKT的mRNA表达量见表2。△△CT=(CT目的基因-CT管家基因)实验组-(CT目的基因-CT管家基因)对照组，用2-△△CT表示mRNA的表达量，对照组为1。T1的AKT基因、T2的K-RAS基因呈低表达。

2.3 关联分析 联用组T3细胞的K-RAS与PI3K mRNA表达量呈正相关(r=0.97，P<0.05)，提示姜黄素可能通过K-RAS影响PI3K的表达，来逆转卵巢癌转基因细胞对卡铂的耐药性。

2.4 Western blot检测K-RAS、p-PI3K及p-AKT的蛋白表达水平 记录K-RAS、p-PI3K及p-AKT的蛋白表达水平，进行灰度翻转，计算其灰度值，见图2。

K-RAS。T1：C4+Cur组较C4组降低(P<0.05)，C8+Cur组较C8降低(P<0.01)；T3：C1+Cur组较C1降低(P<0.05)。T2呈低表达。卡铂姜黄素联用组T1、T3细胞K-RAS的蛋白表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

p-PI3K。T1：C2+Cur较C2降低(P<0.01)；T2：C2+Cur较C2降低(P<0.05)，C4+Cur较C4降低(P<0.01)；T3：C1+Cur较C1降低(P<0.05)，C4+Cur较C4降低(P<0.05)，C8+Cur较C8降低(P<0.01)。C4+Cur组T3的p-PI3K表达量高于T1(P<0.05)。

p-AKT。T2：C2+Cur较C2降低(P<0.01)，C4+Cur较C4降低(P<0.01)；T3：C4+Cur较C4降低(P<0.05)，C8+Cur较C8降低(P<0.05)。C2+Cur组T3的表达高于T1。

3 讨论

本研究应用具有明确基因型的鼠卵巢癌转基因细胞系T1(p53-/-，c-myc，K-RAS)、T2(p53-/-，c-myc，AKT)、T3(p53-/-，K-RAS，AKT)，观察到各浓度卡铂或姜黄素(20 μmol/L)单独作用于T1、T2、T3的细胞增殖抑制率均低于30%，联合应用卡铂与姜黄素组均高于30%，说明鼠卵巢癌转基因细胞系对卡铂具有耐药性，姜黄素逆转了其对卡铂的耐药性。卡铂姜黄素联用组T2、T3的细胞增殖抑制率均高于T1细胞，而T2、T3的细胞增殖抑制率无显著差异。T1与T2均具有c-myc基因，二者的差异可能是由于K-RAS和AKT基因的不同；然而，T1与T3均具有K-RAS基因，由此推断，T2和T3的细胞增殖抑制率高于T1细胞，可能是由于T1细胞缺乏AKT基因，AKT基因是姜黄素逆转卵巢癌细胞耐药性的重要靶点。

卡铂姜黄素联用组T1、T3细胞的K-RAS表达量低于卡铂单用组，联用组T1、T2、T3细胞的PI3K表达量低于卡铂单用组，提示姜黄素逆转卵巢癌细胞对卡铂的耐药性可能与K-RAS、PI3K有关。PI3K是AKT的上游调节因子[8]，提示姜黄素逆转作用与PI3K/AKT信号通路有关。

姜黄素是姜科植物的根茎，在亚洲应用历史悠久。目前认为，姜黄素能影响肿瘤发生发展的多个环节与步骤[9-11]。前期研究结果表明，姜黄素对细胞增殖的抑制率随浓度增高而增加，表现为明显的浓度-效应依赖关系。当姜黄素浓度为20 μmol/L时，作用时间为24 h，其对T1、T2、T3的增殖抑制率为15%～35%，表明单独应用姜黄素对卵巢癌细胞抑制作用较小。有研究表明，姜黄素诱导卵巢癌细胞凋亡具有p53依赖性[12-13]，同时涉及p38丝裂原活化蛋白激酶激活及下调Bcl-2、Bcl-X、Survivin表达和AKT信号。目前，姜黄素在应用中存在的主要问题是生物利用度低，研究合成其衍生物以改善其化学性质近年来已有报道[14-16]。随着对姜黄素抗癌作用机制和构效关系的深入研究，姜黄素将有望作为新型植物来源抗肿瘤药物应用于人类癌症的治疗和预防。活化的RAS基因能直接和PI3K调节亚基p110结合。

表2 T1、T2、T3细胞K-RAS、PI3K及AKT的mRNA水平

注：CG：空白对照组；C1：卡铂浓度1 μg/mL，以此类推；Cur：姜黄素浓度均为20 μmol/L。同种细胞卡铂姜黄素联用组与同浓度卡铂单用组比较，*P<0.05，**P<0.01

图2 T1、T2、T3细胞K-RAS、p-PI3K、p-AKT的蛋白水平

PI3K/AKT信号通路参与抗细胞凋亡，促进细胞增殖、迁移、癌性转化等过程。研究表明，通过降调PI3K/AKT表达可提高卵巢癌对铂类药物的敏感性[17]。研究显示，以PI3Kp110α、AKT为靶点的RNA干扰技术有望成为卵巢癌基因治疗的新策略。PI3K通路并非AKT激活的唯一途径[18]。过表达的Lewis(y)抗原通过激活PI3K/AKT信号转导通路促进卵巢癌RMG-I细胞的增殖，抑制Lewis(y)抗原表达可能是一种治疗Lewis(y)高表达肿瘤的新方法。

MAPK通路中的RAS基因属于GTP酶基因家族，约30%的肿瘤发生中存在RAS基因突变，其中约85%为K-RAS突变，活化的RAS能直接结合并激活PI3K的催化亚基。PI3K/AKT通路与RAS/MAPK通路在功能上十分类似[19]，两者之间存在一定程度的补偿作用，即一条通路的抑制可能导致另一条通路的异常活化。这种作用可以使细胞外的致瘤信号增强，但有时也会使信号减弱。因此，应用具有同时抑制双通路的药物会起到较好的治疗作用。

综上所述，卵巢癌转基因细胞系T1、T2、T3对卡铂具有耐药性，姜黄素可逆转其对卡铂的耐药性，且对含有AKT的T2、T3作用效果更加明显，提示姜黄素逆转卵巢癌对卡铂的耐药性可能与AKT密切相关。通过检测3种细胞的K-RAS、PI3K及AKT表达水平发现，其逆转机制可能与抑制K-RAS、PI3K、AKT的表达有关，也可能直接抑制PI3K/AKT信号通路。

[1] Bast RC,Hennessy B,Mills GB.The biology of ovarian cancer:new opportunities for translation[J].Nat Rev Cancer,2009,9(6):415-428.

[2] Zhang X,Zhang HQ,Zhu GH,et al.A novel mono-carbonyl analogue of curcumin induces apoptosis in ovarian carcinoma cells via endoplasmic reticulum stress and reactive oxygen species production[J].Mol Med Rep,2012,5(3):739-744.

[3] Selvendiran K,Ahmed S,Dayton A,et al.HO-3867,a curcumin analog,sensitizes cisplatin-resistant ovarian carcinoma,leading to therapeutic synergy through STAT3 inhibition[J].Cancer Biol Ther,2011,12(9):837-845.

[4] Wagstaff AJ,Ward A,Benfield P,et al.Carboplatin.A preliminary review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy in the treatment of cancer[J].Drugs,1989,37(2):162-190.

[5] 林春生,曾清芳.异环磷酰胺联合卡铂方案治疗复发性卵巢癌的临床分析[J].临床军医杂志,2015,43(10):1074-1076.

[6] 刘仁杰,段天林,李景钊,等.不同铂类药物联合长春瑞滨治疗晚期非小细胞肺癌临床效果及安全性分析[J].中国医药,2015,10(9):1289-1292.

[7] 张潇.赵庆春.601例非小细胞肺癌患者化疗用药分析[J].创伤与急危重病医学,2016,4(3):158-161.

[8] Ghosh A,Lai C,McDonald S,et al.HSP27 expression in primary colorectal cancers is dependent on mutation of KRAS and PI3K/AKT activation status and is independent of TP53[J].Exp Mol Pathol,2013,94(1):103-108.

[9] Mosieniak G,Adamowicz M,Alster O,et al.Curcumin induces permanent growth arrest of human colon cancer cells:link between senescence and autophagy[J].Mech Ageing Dev,2012,133(6):444-455.

[10] Seo JH,Jeong KJ,Oh WJ,et al.Lysophosphatidic acid induces STAT3 phosphorylation and ovarian cancer cell motility:their inhibition by curcumin[J].Cancer Lett,2010,288(1):50-56.

[11]王亚华,应雪,张春春,等.替莫唑胺联合姜黄素对C6 胶质瘤细胞凋亡的作用[J].实用医学杂志,2016,32(10):1564-1567.

[12]Yunos NM,Beale P,Yu JQ,et al.Synergism from sequenced combinations of curcumin and epigallocatechin-3-gallate with cisplatin in the killing of human ovarian cancer cells[J].Anticancer Res,2011,31(4):1131-1140.

[13]Shi M,Cai Q,Yao L,et al.Antiproliferation and apoptosis induced by curcumin in human ovarian cancer cells[J].Cell Biol Int,2006,30(3):221-226.

[14]Dayton A,Selvendiran K,Kuppusamy ML,et al.Cellular uptake,retention and bioabsorption of HO-3867,a fluorinated curcumin analog with potential antitumor properties[J].Cancer Biol Ther,2010,10(10):1027-1032.

[15]Zhang X,Zhang HQ,Zhu GH,et al.A novel mono-carbonyl analogue of curcumin induces apoptosis in ovarian carcinoma cells via endoplasmic reticulum stress and reactive oxygen species production[J].Mol Med Rep,2012,5(3):739-744.

[16]Selvendiran K,Ahmed S,Dayton A,et al.Safe and targeted anticancer efficacy of a novel class of antioxidant-conjugated difluorodiarylidenyl piperidones:differential cytotoxicity in healthy and cancer cells[J].Free Radic Biol Med,2010,48(9):1228-1235.

[17]el-SA A,Zhu Q,Barakat BM,et al.Tangeretin sensitizes cisplatin-resistant human ovarian cancer cells through downregulation of phosphoinositide 3-kinase/Akt signaling pathway[J].Cancer Res,2009,69(23):8910-8917.

[18]Liu J,Lin B,Hao Y,et al.Lewis y antigen promotes the proliferation of ovarian carcinoma-derived RMG-I cells through the PI3K/Akt signaling pathway[J].J Exp Clin Cancer Res,2009,28:154.

[19]De Luca A,Maiello MR,D′Alessio A,et al.The RAS/RAF/MEK/ERK and the PI3K/AKT signalling pathways:role in cancer pathogenesis and implications for therapeutic approaches[J].Expert Opin Ther Targets,2012,16(Suppl 2):S17-S27.

Effect of curcumin combined with carboplatin on ovarian cancer transgenic cell lines

GAO Ying-zhuo,KONG Ling-ting,QI Ya-fei,WANG Jin-ou,CAO Cheng-cheng,LÜ Qing-jie*

(Department of Pathology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To investigate the effect of curcumin combined with carboplatin on rat′s ovarian cancer transgenic cell line T1,T2 and T3.Methods The effect of carboplatin and curcumin alone and in combination on proliferation of rat′s ovarian cancer transgenic cell lines was detected by MTT method,and the expression levels of K-RAS,PI3K and AKT were detected by RT-PCR and Western blotting.Results The cell inhibition rate of proliferation of different concentrations of carboplatin alone on rat ovarian cancer transgenic cell line T1,T2 and T3 was less than 30%;the rate was more than 30% after combination use of carboplatin and curcumin (P<0.05);the effect on T2 and T3 which was transfected with AKT was more obvious.The expression of K-RAS,PI3K (p-PI3K) and AKT (p-AKT) in T1,T2 and T3 of combination group was lower than that of carboplatin group.Conclusion Rat ovarian cancer transgenic cell lines T1,T2 and T3 are resistant to carboplatin.Curcumin can reverse the drug resistance to carboplatin,especially for T2 and T3 cells which contain AKT.The reverse effect of curcumin may be related to the inhibition of the expression of K-RAS,PI3K and AKT or direct inhibition of PI3K/AKT signaling pathway.

Curcumin;Carboplatin;Ovarian cancer

2017-01-13

中国医科大学附属盛京医院病理科，沈阳 110004

辽宁省科技攻关计划项目(2013225021)；辽宁省“百千万人才工程”资助项目(2011921040)；沈阳市科技创新专项资金(F14-231-1-46)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706004

*通信作者