肝复康经JNK信号通路在肝星状细胞凋亡中的调节机制

李 骢，李寒姝，张彩华，姜妙娜，袁丽君，贾玉杰

肝复康经JNK信号通路在肝星状细胞凋亡中的调节机制

李 骢，李寒姝，张彩华，姜妙娜，袁丽君，贾玉杰*

目的 探讨中药肝复康经JNK(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路在肝星状细胞凋亡中的调节机制。方法 将SD大鼠随机分为5组：正常对照组(C)，模型组(M)，肝复康高(HT)、中(MT)、低(LT)剂量治疗组，每组给予相应的处理；HSC-T6细胞株随机分为3组：正常对照组、乙醛组及肝复康治疗组。HE染色法观察肝组织形态结构变化；RT-PCR法测定MKK4、MKK7、JNK1、JNK2、COX-2、Survivin、Caspase-3、α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的基因表达水平；免疫组织化学法和免疫蛋白印记法观察COX-2在肝组织和肝星状细胞中的表达。结果 正常组中COX-2几乎不表达。与正常组相比，模型组中COX-2表达显著增加(P<0.05)。与模型组相比，肝复康治疗组各组中COX-2表达均明显降低，其中，中剂量组最明显(P<0.05)。与正常组相比，模型组中MKK4、MKK7、JNK1、JNK2、COX-2、Survivin的基因表达水平均显著上调(P<0.05)。与模型组相比，肝复康治疗组各基因表达水平均明显减弱，中剂量组最明显(P<0.05)，其中Caspase-3基因表达呈相反趋势。COX-2和Survivin的表达呈正相关，和Caspase-3的表达呈负相关。检测α-SMA、collagenⅠ与collagenⅢ基因表达，与模型组相比，中剂量治疗组表达水平明显下调(P<0.05)。结论 肝复康可通过抑制JNK信号通路的传导诱导肝星状细胞凋亡，发挥抗纤维化作用。

肝纤维化；JNK；肝复康；肝星状细胞；凋亡

0 引言

肝纤维化系指肝组织内细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)过度增生与异常沉积，导致肝脏结构、功能发生异常改变[1-2]。其病理变化的中心事件是肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)激活并产生大量ECM，ECM的分泌增加，而降解减少，以致其在肝内大量沉积，导致肝纤维化逐渐形成。肝纤维化是所有慢性肝病进展成肝硬化的共同病理基础[3-4]，且具有逆转的可能[5]。因此一直以来都是相关研究领域的热门课题。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase，JNK)是丝裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中转导并调控细胞凋亡信号的重要信号通路。JNK信号通路可以被多种胞外刺激激活，JNK有2个双特异性上游激酶：丝裂原活化蛋白激酶激酶4 (Mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4)和丝裂原活化蛋白激酶激酶7 (Mitogen-activated protein kinase kinase 7，MKK7)。研究表明，JNK参与了肝纤维化的发生发展[6]，然而，目前JNK在凋亡中的作用尚不明确。环氧化酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是一种诱导酶，在炎症反应和肿瘤的发生发展中发挥重要作用。COX-2可以通过激活HSC从而在肝纤维化的发生发展中起到重要作用。而JNK通路的激活又可以调控COX-2的表达。Caspase在凋亡过程中处于关键地位，Caspase-3是各凋亡通路的最终执行者。Survivin是一种凋亡抑制蛋白，可通过多种调控机制发挥其强大的抗凋亡作用，促进细胞增殖。而COX-2可以通过上调Survivin的表达、下调Caspase-3的表达来实现其抗凋亡的作用。

本实验采用CCI4诱导的肝纤维化模型，对于离体实验部分选用乙醛作为有效刺激HSC-T6细胞的激活因子。目前许多研究证明，传统中药由于其多途径、多靶点、不良反应少的特点，在肝纤维化的治疗中具有显著疗效[7]。本实验通过研究中药肝复康对JNK信号通路在肝星状细胞凋亡中的影响，以期探索肝纤维化治疗的新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 山羊抗大鼠COX-2多克隆抗体、兔β-actin多克隆抗体由Santa Cruz公司提供，兔血清工作液由北京中杉公司提供，二步法免疫组化检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，DAB显色液由北京中杉公司提供，PCR试剂盒由北京天根生物技术有限公司提供，引物由大连宝生物工程有限公司提供，胎牛血清由美国Sigma公司提供。

1.1.2 动物 清洁级健康SD大鼠55只，雌雄不限，体重180～220 g，由大连医科大学实验动物中心提供。

1.1.3 药物 肝复康制剂由丹参、黄芪、白芍、白术、当归、茯苓、赤芍、生地、柴胡、甘草、枳壳组成，其中以黄芪与丹参为主要成分，其次为茯苓与枳壳。前期多次预试验已经确定了中药的治疗剂量。

1.1.4 细胞 大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞株由上海中医药大学肝病研究所徐列明教授赠送。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 清洁级健康SD大鼠55只，体重180～220 g，雌雄不限，随机分为5组：正常对照组(C)，模型组(M)，肝复康高(HT)、中(MT)、低(LT)剂量治疗组。

1.2.2 造模 除正常对照组外，其余组大鼠每周2次皮下注射橄榄油稀释的10% CCI4(0.5 mL/kg)共12周。正常对照组注射同体积生理盐水。第12周末，处死模型组和正常组大鼠，迅速取出肝组织。肝复康治疗组从CCI4注射的第9周开始，分别给予高、中、低剂量肝复康治疗[3 125、312.5、31.25 mg/(kg·d)]，至第20周末，与正常对照组一同处死，迅速取出肝组织。所有大鼠均标准饲料喂养，自由饮水。

1.2.3 药物血清的制备 SD清洁级大鼠20只，体重300～350 g，雌雄各半。大鼠随机分为2组，每组10只，分别为正常对照组和肝复康治疗中剂量组。肝复康治疗中剂量组大鼠每日中剂量肝复康灌胃1次，灌胃1周。最后一次灌胃前12 h禁食，灌胃后1 h用苯巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，在无菌条件下，打开腹腔，腹主动脉取血，取血后3 000 r/min、4 ℃离心10 min，离心后血清在无菌细胞间用0.22 μm滤器抽滤后，于56 ℃、30 min条件下灭活。置-80 ℃冰箱中保存备用。正常对照组血清制备方法同上。

1.2.4 细胞培养 大鼠HSC-T6细胞株用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DEMN培养基于37 ℃、5% CO2混合气体的孵箱中培养，所有细胞用无血清的DEMN培养基培养24 h后随机分为3组：正常对照组(含10%正常大鼠血清的DEMN培养基)；乙醛组(含10%正常大鼠血清、乙醛200 μmol/L的DEMN培养基)；肝复康治疗组(含10%肝复康治疗中剂量组大鼠血清、乙醛200 μmol/L的DEMN培养基)。以上三组细胞均在37 ℃、5% CO2混合气体的孵箱中培养48 h。

1.2.5 肝脏病理学评估标准 肝组织经多聚甲醛固定后制成4 μm厚石蜡切片，HE染色，光镜下观察肝脏组织形态结构变化。Ishak评分标准：0，正常组织，没有发生纤维化；1+，部分汇管区发生纤维化，有或没有短的纤维间隔；2+，汇管区纤维化，纤维间隔形成；3+，大部分汇管区纤维化伴明显门门桥接；4+，可见门门桥接和门静脉-中心静脉桥接；5+，显著的门门桥接和/或门静脉-中心静脉桥接，偶有结节。

1.2.6 免疫组织化学分析 石蜡常规脱蜡至水；3% H2O2滴到组织切片上，室温静置15 min，灭活内源性酶；高压热抗原修复，修复液为0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，5 min；滴加正常兔血清封闭液，室温20 min；滴加稀释后的一抗(COX-2稀释比例为1∶100) 4 ℃过夜；加生物素化二抗，37 ℃水浴箱中20 min；加辣根过氧化物酶标记，37 ℃水浴箱中20 min；DAB显色，苏木素复染3 min，流水冲洗10 min；氨水返蓝，脱水，透明，封片。镜检：组织中棕黄色颗粒沉淀为阳性表达区域。Image-Pro-plus 图像分析软件进行定量分析，显微镜下每张切片随机选取10个视野，统计这些区域累计光密度值(IOD)，计算平均光密度值。

1.2.7 RT-PCR法测定基因表达水平 Trizol法提取总RNA，4 ℃孵育5 min；加入氯仿，盖紧盖后用力震荡15 s，4 ℃孵育5 min；4 ℃、12 000 r/min离心15 min；移取上清至离心管中，加入250 μL异丙醇，混匀，-20 ℃静置30 min；4 ℃、12 000 r/min离心10 min；弃上清，缓慢加入事先用冰预冷的75%乙醇1 mL，4 ℃、10 000 r/min离心5 min；弃上清保留沉淀，滤纸上倒置，空气干燥5～10 min；加30 μL去DEPC水，室温静置10 min；琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA纯度及完整性，应用Quant Reverse Transcriptase逆转录合成cDNA。以适量cDNA为模板、β肌动蛋白(β-actin)为内参照，PCR扩增各基因片段。RT-PCR相关引物序列及反应条件见表1。循环参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54～66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环；72 ℃时延伸5 min。取5 μL PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，置于凝胶图像分析(UVP)检测条带灰度，以β-actin作为内参校正，计算目的基因与β-actin基因扩增条带像素灰度比值，并作为目的基因mRNA表达的相对水平。每个样本、每个指标重复测量3次，取均值。

表1 RT-PCR相关引物序列及反应条件

1.2.8 免疫蛋白印记(Western blot)检测 分别提取组织与细胞中的总蛋白，配置聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶5%，分离胶10%；按顺序上样，加入电泳液，跑胶电流：上胶25 mA，下胶30～35 mA。当电泳跑至底部需要位置时停止电泳；将电泳后凝胶切至需要大小，测量，将6张滤纸和PVDF膜剪成胶的大小，连同胶一起放入转移缓冲液中平衡10 min；按顺序制作“三明治”，连接石墨转膜仪电源，转膜50 min左右；取出转膜后的PVDF膜，放入TBS和Tween20配置的5%脱脂奶粉封闭液中4 ℃过夜；取出封闭后的PVDF膜，加入用5%脱脂奶粉稀释后的一抗(COX-2稀释比例为1∶300)，于37 ℃摇床中孵育3 h，TBST洗膜3次，每次10 min；加入按比例稀释的HRP标记的二抗(稀释比例为1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次12 min；配置需要体积的ECL发光液，将PVDF膜去除残液，放入X光片夹中，滴上ECL发光液；暗室中打开X光片夹，根据荧光强弱来决定曝光时间。曝光完成后迅速取出胶片，浸入显影液中晃动，当胶片上出现明显条带后，即刻终止显影，将胶片放入定影液中，不停晃动，至胶片透明为止。然后用自来水冲去残留的定影液终止反应。室温下晾干。

2 结果

2.1 肝组织形态学改变肉眼观察 正常组大鼠肝脏表面光滑，颜色红润，质地柔软。模型组大鼠肝脏固缩，表面粗糙有结节，呈土黄色，肝质硬而脆，包膜紧张，油腻感。肝复康治疗组与模型组比较肝脏略肿大，表面较光滑，质地较柔软。根据Ishak评分，各组纤维化程度评分见表2。HE染色组织病理切片：正常组大鼠肝小叶结构完整、清晰，肝索放射状排列，无炎症细胞浸润(图1A)。模型组大鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞排列紊乱，大量纤维组织增生，假小叶形成，肝细胞肿大，脂肪变性明显，部分坏死，炎症细胞大量浸润(图1B)。与模型组相比，肝复康治疗组大鼠肝脏均有不同程度改善，中剂量组效果最明显，肝小叶结构明显改善，纤维增生明显减轻，纤维间隔变细，肝细胞脂肪变性得到改善 (图1C～图1E)。

表2 GFK对肝纤维化评分的影响

注：*与正常对照组比较，P<0.05；#与模型组比较，P<0.05

2.2 免疫组织化学检测肝复康对COX-2在肝组织中表达的影响 COX-2在正常组大鼠肝组织几乎无表达，或偶尔少量表达于Disse间隙，门管区基底膜或间质细胞(图2A)。在模型组大鼠肝组织中，可见大量棕黄色颗粒广泛分布于细胞浆中，尤其在中心静脉周围的肝细胞和门静脉周围肥大的Kupfffer细胞中最为明显(图2B)。与模型组相比，肝复康治疗组COX-2阳性表达显著减少(图2C～图2E)，以中剂量组最为明显。见图3。

2.3 Western blot检测肝复康对COX-2在肝组织及HSC中表达的影响 正常组大鼠肝组织及细胞中COX-2低表达。与正常组相比，模型组大鼠肝组织及细胞中COX-2表达显著上调。与模型组相比，肝复康治疗组大鼠肝组织及细胞COX-2表达显著下调(见图4)。COX-2蛋白在各组中表达趋势和基因表达相一致。

2.4 RT-PCR检测肝复康对大鼠肝组织JNK通路各指标mRNA表达的影响 见图5、表3。

与正常对照组相比，模型组中JNK通路主要的标志酶-MKK4、MKK7、JNK1和JNK2的mRNA表达明显增多。与模型组相比，肝复康治疗组各个酶的表达明显降低，中剂量最为明显。对于COX-2和Survivin的表达，与正常组相比，模型组表达显著上调。肝复康治疗组COX-2和Survivin的表达较模型组明显下调，以中剂量组最为明显。模型组凋亡蛋白Caspase-3的表达较正常组显著下调。与模型组相比，肝复康治疗组Caspase-3表达显著上调，中剂量组最为显著。为了证明凋亡的发生，本实验亦检测了凋亡标志物α肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(ColleganⅠ)、Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ)的mRNA表达。与模型组相比，肝复康治疗组中各指标的表达明显下调。

图1 肝组织病理形态变化(HE，400×)

图2 免疫组织化学检测肝组织表达

图3 免疫组织化学检测肝复康对COX-2在肝组织中表达的影响

图4 Western blot检测肝复康对COX-2的影响

注：A.肝组织数据分析；B.细胞数据分析。图4A中，C为正常对照组，M为模型组，HT为GFK高剂量组，MT为GFK中剂量组，LT为GFK低剂量组；图4B中，C为正常对照组，M为乙醛组，MT为GFK治疗组。*与C组比较，P<0.05；#与M组比较，P<0.05

图5 JNK通路各指标mRNA的表达

注：肝组织中，C为正常对照组，M为模型组，HT为GFK高剂量组，MT为GFK中剂量组，LT为GFK低剂量组；HSC中，C为正常对照组，M为乙醛组，MT为GFK治疗组

2.5 相关性分析 COX-2与JNK1、JNK2、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA之间均呈正相关(P<0.01),见表4。COX-2与Survivin之间呈正相关，与Caspase-3之间呈负相关，见表5。

2.6 肝复康对HSC-T6 的作用 细胞RT-PCR结果显示，乙醛组中JNK通路主要标志酶、COX-2和Survivivn的表达与正常组相比明显上调；而肝复康治疗组中上述指标的表达和乙醛组相比明显下调(图5、表6)。乙醛组中Caspase-3的表达与正常组相比明显下调，肝复康治疗组中Caspase-3的表达与乙醛组相比明显上调(图5、表6)。在Western blot实验中，乙醛组中COX-2的蛋白表达水平与正常组相比明显增多，肝复康治疗组中COX-2的蛋白表达水平与乙醛组相比明显减少(图4)。

表3 JNK通路各指标mRNA 在肝组织中的表达

注：与C组比较，*P<0.05，**P<0.01；与M组比较，#P<0.05，##P<0.01

表4 COX-2与JNK1、JNK2、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和α-SMA之间的相关性分析

表5 COX-2与Survivin、Caspase-3之间的相关性分析

表6 肝复康对HSC-T6相关基因mRNA的影响

注：与C组比较，*P<0.05，**P<0.01；与M组比较，#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝损伤进展为肝硬化的必经阶段，发病率较高。本实验采用的中药肝复康是以黄芪、丹参、白芍、赤芍、柴胡等为主要成分的中药复方，具有活血化瘀、软坚消症的功效。尽管目前尚未应用于临床治疗，但以往的动物实验已多次成功证实了肝复康对肝纤维化组织具有预防及治疗作用[8-9]。

HSC是位于肝血窦内皮细胞与肝细胞之间的一种肝非实质细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(Myofibroblastic-like cell，MFC)。体内外实验均已证实，活化的HSC在肝纤维化的发生发展中起重要作用，亦是ECM的主要来源[10-11]。HSC活化的主要特征是HSC的大量而频繁的增殖和α-SMA的表达，活化的HSC合成大量ECM，包括CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、层黏连蛋白、透明质酸、纤维连接蛋白等多种ECM成分。凋亡在肝纤维化的逆转中亦起到关键作用，HSC凋亡不仅可以减少已经活化的HSC的数量，还可以抑制HSC活化，进而有利于ECM的降解和肝纤维化的逆转。

JNK是MAPK家族中转导并调控细胞凋亡信号的重要传导通路[12]。JNK位于胞质，作为JNK的2个特异性上游激酶，MKK4和MKK7通过双磷酸化JNK的Thr、Tyr位点而激活JNK。JNK通路的活化也参与了HSC的活化和增殖，有研究证明，在大鼠HSC实验中使用JNK特异性抑制剂抑制JNK活性，可以有效抑制肝星状细胞的增殖，而且随着抑制剂剂量的增加，其抑制 HSC 增殖的作用逐渐增强，表明激活JNK信号转导通路与HSC的增殖和肝纤维化有着密切关系[13]。

本研究结果表明，与正常组相比，模型组中，随着JNK通路中的2个特异性上游激酶MKK4和MKK7表达上调，JNK1和JNK2的表达亦显著上调，同时，α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达均上调；而与模型组相比，肝复康治疗组中，MKK4和MKK7的表达显著下调，JNK1和JNK2的表达亦明显下调，同时α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达均相应下调。与离体实验结果相一致。结果表明，在CCI4诱导的肝纤维化大鼠和乙醛刺激的HSC中，JNK通路通过发挥抑制HSC凋亡的作用来促进肝纤维化的发展，而肝复康可以通过抑制JNK通路的表达来促进HSC凋亡的发生，最终缓解肝纤维化程度。

COX-2是一种炎症反应过程中的诱导酶，具有促进HSC活化的作用[14]。JNK通路的激活也参与了对COX-2表达的调控。本实验结果也证实了JNK通路在COX-2的表达调控中发挥重要作用。在COX-2抑制细胞凋亡事件中，两种凋亡相关因子Caspase-3和Survivin亦起到重要作用。本研究显示，与正常组相比，模型组中COX-2、Survivin的表达明显增多，而Caspase-3的表达相对减少；在肝复康治疗组中，伴随着COX-2表达的下调，Survivin亦显著下调，而Caspase-3表达明显上调，即COX-2和Survivin的表达呈正相关，而与Caspase-3的表达呈负相关。以上结果证实，在CCI4诱导的肝纤维化大鼠和乙醛刺激的HSC中，COX-2通过发挥抑制凋亡作用，促进肝纤维化的发展，其抑制凋亡的发生是通过上调Survivin表达、下调Caspase-3表达的途径来实现的。

综上所述，传统中药复方制剂肝复康对于CCI4诱导的肝纤维化大鼠和乙醛刺激的HSC具有一定的抗纤维化作用，其机制可能是通过抑制JNK信号通路的传导进而诱导HSC的凋亡来实现的。期待随着细胞生物学、基因治疗等研究的深入发展，能够有更多新靶点、新途径的抗肝纤维化药物被研发。

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Regulation mechanisms of Ganfukang in hepatic stellate apoptosis through JNK signaling pathways

LI Cong,LI Han-shu,ZHANG Cai-hua,JIANG Miao-na,YUAN Li-jun,JIA Yu-jie*

(Department of Pathophysiology,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

Objective To explore the regulation mechanisms of Ganfukang (GFK) in hepatic stellate cells (HSC) apoptosis through JNK signaling pathways.Methods All the SD rats were randomly divided into 5 groups:normal control group (group C),model group (group M) and high,middle and low dose treatment groups (group HT,group MT and group LT).HSC-T6 cell line was randomly divided into three groups:control group,acetaldehyde group and GFK group.The pathological changes of hepatic tissues were observed under light microscope by HE staining.The mRNA expression of MKK4,MKK7,JNK1,JNK2,COX-2,Survivin,Caspase-3,α-SMA,typeⅠcollagen and typeⅢcollagen was measured by RT-PCR,and the hepatic expression of COX-2 was detected by immunohistochemistry and western blot.Results The COX-2 was rarely expressed in group C.The expression of COX-2 protein in group M increased more significantly than that of group C (P<0.05).Compared with group M,the expression of COX-2 protein decreased in group MT (P<0.05).The expression levels of main kinases in JNK pathway (MKK4,MKK7,JNK1 and JNK2) and Survivin in group M were higher than those of group C (P<0.05),and they were lower in GFK treatment groups than those of group M (P<0.05),while the tendency of expression levels in Caspase-3 mRNA was contrary.The expression of COX-2 was significantly positively correlated with Survivin,and negatively correlated with Caspase-3.The expression of colleganⅠ,collagenⅢ and α-SMA mRNA in group MT was lower than that of group M (P<0.05).Conclusion GFK has therapeutic effect on liver fibrosis by inducing the apoptosis of HSC through inhibiting the transduction of JNK signal pathway in liver fibrosis.

Liver fibrosis;JNK;Ganfukang;HSC;Apoptosis

2017-01-21

大连医科大学病理生理学教研室，大连 116044

辽宁省教育厅课题(2009A190)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706003

*通信作者