正交设计试验优化银杏叶多酚提取条件的研究

张春生，田 艳，张 萍，王毅红，谭 萍

（1.六盘水师范学院，贵州六盘水553004；2.六盘水市第十一中学，贵州六盘水553004）

正交设计试验优化银杏叶多酚提取条件的研究

张春生1，田 艳2，张 萍1，王毅红1，谭 萍1

（1.六盘水师范学院，贵州六盘水553004；2.六盘水市第十一中学，贵州六盘水553004）

以没食子酸为标准品的福林酚法提取银杏叶多酚，并采用正交设计试验探究银杏叶多酚提取的最佳条件。试验结果表明，银杏叶多酚提取的最佳条件为福林试剂用量4 mL，福林试剂用量与10%碳酸钠的配比1∶2，反应时间120 min，反应温度45℃。

银杏叶；多酚；福林法；正交设计

银杏（GinkgobilobaLinn）属银杏科（Ginkgoceae）银杏属（Ginkgo Linn）植物，别名白果、公孙树、鸭脚子，属裸子植物，与它同门的所有其他植物都已灭绝，被称为“孑遗植物”，在我国广泛分布，贵州省盘县石桥镇妥乐村有古树分布[1]。银杏的种子、银杏根、银杏叶均可以入药，并被广泛用于医药界[2-6]。

植物中广泛存在一类被誉为“第七类营养素”的多酚化合物，酚类化合物是植物次生代谢产物中的重要类型之一，因其具有显著的抗氧化、抗癌、抗炎及抗突变活性而引起人们的广泛关注。对多酚提取的研究现在学界较普遍的方法主要有福林酚法、高锰酸钾法[7]、紫外分光光度法[8]和酒石酸亚铁比色法[9]等方法，而福林酚法以其稳定性、易操作的特点使用较广泛。采用福林酚法并以正交设计试验探究黔产古银杏叶多酚的提取条件，为开发利用银杏叶资源提供参考。

1 原料及试验方法

1.1 原料、药品及仪器

1.1.1 原料、药品

古银杏叶，采自贵州盘县石桥镇妥乐古银杏之乡，叶片为秋季成熟黄色叶片；没食子酸标准品；乙醇、钼酸钠、浓磷酸、浓盐酸、钨酸钠、硫酸锂、无水碳酸钠、溴水，以上试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器

TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，DK-98-1型电热恒温水浴锅，METTLERTOLEDOAL204型电子天平，万能粉碎机，硫酸干燥器。

1.2 方法

1.2.1 福林（FC）试剂的配制

按照徐辉艳等人[10]福林试剂的配制，冷藏备用。

1.2.2 制备银杏叶多酚样品原液

银杏叶自然风干后粉碎过40目筛，取25 g银杏叶粉末样品置于容量瓶中加入35%乙醇溶液100 mL，于35℃恒温水浴锅浸提120 min，浸提液过滤为银杏叶多酚原液，定容至100 mL。

1.2.3 标准曲线的制作

按照王岸娜等人[11]标准曲线制作方法求得回归方程，绘制工作曲线。回归方程为Y=0.131 1X+0.119 1，R2=0.999 6。

标准曲线见图1。

图1 标准曲线

1.2.4 测定银杏叶多酚样品原液

取2 mL银杏叶多酚样品原液，按照标准曲线的制作操作福林试剂的显色。

2 结果与分析

2.1 波长选择

准确吸取没食子酸标准液与银杏叶多酚样品原液，经福林试剂显色后，分别于波长600～900 nm范围内扫描，经光吸收曲线比较，二者相同，且确定吸收波长为762 nm。

2.2 福林试剂和10%Na2CO32种溶液配比与吸光度的关系

取2 mL银杏叶多酚样品原液，分别加入不同比例的福林试剂和10%Na2CO3溶液，水浴保温显色，于波长762 nm处测其吸光度。

试剂配比与吸光度的关系见图2。

图2 试剂配比与吸光度的关系

试验表明吸光度为最大值时，福林试剂和10% Na2CO3用量（mL）的配比为1∶2。

2.3 福林试剂用量与吸光度的关系

取2 mL银杏叶多酚样品原液，不同用量的福林试剂加入原液中，水浴保温显色，于波长762 nm处测其吸光度。

福林试剂用量与吸光度的关系见图3。

试验表明，在其他同等因素下，当福林试剂不断增加，吸光度先随着增大一定程度后减小，吸光度为最大值时福林试剂用量为3.5 mL。

2.4 反应时间与吸光度关系

图3 福林试剂与吸光度的关系

准确吸取2 mL银杏叶多酚样品原液于50 mL容量瓶中，吸取3.5 mL福林试剂加入原液中，置于35℃的恒温水浴锅中保温30～150 min，于波长762 nm处测其吸光度。

反应时间与吸光度的关系见图4。

图4 反应时间与吸光度的关系

试验表明，在其他同等因素下，随着反应时间增加，吸光度也缓慢增加，120 min时吸光度为最大值，120 min之后吸光度开始下降。

2.5 反应温度与吸光度关系

准确吸取2 mL银杏叶多酚样品原液于50 mL容量瓶中，吸取3.5 mL福林试剂加入原液中，置于15～50℃的恒温水浴锅中保温60 min，于波长762 nm处测其吸光度。高温对多酚结构会产生破坏，不宜验证过高温度。

反应温度与吸光度的关系见图5。

图5 反应温度与吸光度的关系

试验表明，在其他同等因素下，随着反应温度升高吸光度呈上升趋势，于45℃水浴锅中保温时吸光度达到最大值，50℃水浴锅中保温时的吸光度降低。

2.6 显色条件下的正交设计试验[12]

根据上述福林试剂用量（A）、福林试剂与10% Na2CO3的配比（B）、反应时间（C）、反应温度（D）各因素试验结果，现将这4个因素作为试验因素，吸光度为考查指标，采用L9（34）正交表进行试验。

试验因素与水平设计见表1，正交试验结果见表2。

表1 试验因素与水平设计

表2 正交试验结果

由表2可知，各因素影响吸光度大小顺序为福林试剂与10%Na2CO3的配比＞福林试剂用量＞反应温度＞反应时间，即正交试验表中B＞A＞D＞C，且正交试验表明各因素的最佳组合为A3B2C3D2。

3 结论

以贵州省盘县古银杏之乡古银杏叶为原料，对银杏叶多酚提取条件进行优化，并进一步对正交试验结果进行分析，得出福林试剂用量4 mL，福林试剂与10%Na2CO3的配比1∶2，反应时间120 min，反应温度45℃为银杏叶多酚提取的最佳适宜条件。试验结果为进一步研究银杏叶多酚含量的测定及银杏叶多酚的抗氧化活性提供了基础，对古银杏叶的开发利用提供一定参考。

[1]左经会．六盘水药用植物[M]．北京：科学出版社，2012：1-2.

[2]宋贵栎．银杏叶注射液治疗冠心病心绞痛的临床疗效及安全性[J]．药物与临床，2013，20（7）：66-67.

[3]张继成，吕文利．银杏叶提取物对于BPA活化RBL-2H3分泌IL-13的影响[J]．中国免疫学杂志，2013，29（2）：144-147.

[4]王春艳，田晶，高俊涛．银杏叶提取物对糖尿病大鼠血液生化指标的影响[J]．吉林医药医学院学报，2013，34（1）：19-20.

[5]马乔娟．银杏叶提取物对绝经后冠心病妇女冠脉血流及血管弹性的影响[J]．西部中医药，2013，26（2）：24-26.

[6]王树芳，徐海英，李萌，等.银杏叶提取物对急性肝衰竭大鼠肝脏组蛋白去乙酰化酶2表达的影响[J]．中国

[7]老年学杂志，2013，33（4）：860-862.王文杰.高锰酸钾测定法测定茶多酚有关用剂的特性研究[J].福建茶叶，2002（1）：15-17.

[8]卜彦花，周娜娜，王春悦，等.福林酚试剂法和紫外分光光度法测定冬枣多酚含量的比较研究[J].中国农学通报，2012，28（1）：212-217.

[9]刘蓓蓓，陈胜璜，邹菊英，等.酒石酸亚铁比色法测定黄鹂芽中茶多酚的含量[J].中南药学，2011（10）：740-741.

[10]徐辉艳，孙晓东，张佩君，等.红枣汁中总酚含量的福林法测定[J].食品研究与开发，2009，30（3）：126-128.

[11]王岸娜，徐山宝，刘小彦，等.福林法测定猕猴桃多酚含量的研究[J].食品科学，2008，29（7）：398-401.

[12]谭萍，张萍，王玉珠，等.荞麦多糖的提取方法及含量测定[J].湖北农业科学，2008，47（8）：955-956.◇

Orthogonal Experimental Design Optimization Study of Ginkgo Biloba Polyphenols Extraction Conditions

ZHANG Chunsheng1，TIAN Yan2，ZHANG Ping1，WANG Yihong1，TAN Ping1
（1.Liupanshui Normal University，Liupanshui，Guizhou 553004，China；2.Liupanshui City No.11 Middle School，Liupanshui，Guizhou 553004，China）

Using forint phenol method as standard substance to extract ginkgo biloba polyphenol，the optimum conditions of extraction of ginkgo biloba polyphenol are investigated by orthogonal design.The results show that the optimum conditions are as follows：forint reagent dosage is 4 mL，forint reagent dosage and 10%sodium carbonate is 1∶2，reaction time is 120 min and reaction temperature is 45℃.

ginkgo biloba；polyphenol；folin method；orthogonal design

R284

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.037

1671-9646（2017）05b-0034-03

2017-04-20

六盘水师范学院科研基金资助项目“黔产古银杏叶多酚抗氧化活性研究”（LPSSY201213）。

张春生（1982—），男，本科，实验师，研究方向为植物学实验及实验室建设管理。