超声提取柑橘皮中总黄酮的研究

张冬冬，徐 迪，洪 伟

（芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽芜湖241003）

超声提取柑橘皮中总黄酮的研究

张冬冬，徐 迪，洪 伟

（芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽芜湖241003）

选用超声法提取柑橘皮中的总黄酮，将单因素试验分析与正交试验相结合，得到超声法提取柑橘皮中黄酮类化合物的最佳工艺条件为乙醇体积分数70%，料液比1∶25，提取液pH值8，提取时间60 min，提取次数3次，在此条件下总黄酮提取率为2.68%。

柑橘皮；总黄酮；超声提取；影响因素

黄酮类化合物是重要的一类含氧杂环天然有机化合物，广泛存在于一些植物和浆果中，在柑橘皮中已经鉴定出60多种黄酮类化合物[1]，它们具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等多种生理活性，在食品和医药行业有着广泛应用。柑橘类水果包括橘、柑、橙、柚、枳、椽等，是世界上产量最大的水果，但目前柑橘类果皮绝大部分作为废料丢弃，造成极大的资源浪费。试验尝试使用超声法从柑橘皮中提取黄酮类物质，为柑橘类果皮的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

市售新鲜柑橘，清洗除杂后剥皮切片，在65℃条件下干燥至恒质量，粉碎后过40目筛备用。

1.2 试剂

芦丁标准品，上海伊卡生物技术有限公司提供；石油醚（60～90℃）、无水乙醇，以及NaOH，Al（NO3）3，NaNO2，均为国产分析纯。

1.3 仪器

台式超声波清洗器、紫外可见分光光度计、分析天平、高速万能粉碎机、台式高速离心机、恒温干燥箱等。

1.4 芦丁标准曲线的建立

精确称取19.97 mg芦丁标准品置于100 mL容量瓶中，加入体积分数60%的乙醇溶解，稀释至刻度，精确量取25 mL置于50 mL容量瓶中，用体积分数60%的乙醇稀释至刻度，即得0.099 85 mg/mL的标准溶液。

取标准溶液2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 mL分别置于25 mL容量瓶中，加体积分数60%的乙醇补足至12.5 mL，加5%NaNO2溶液0.75 mL，摇匀后静置5 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.75 mL，摇匀后静置5 min，最后加入1.013 mol/L NaOH溶液10 mL，定容至刻度，于波长510 nm处测其吸光度[2]，以芦丁质量浓度为横坐标（X）、吸光度A为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程：Y=11.22X+ 0.000 8，R2=0.999 9。

芦丁标准曲线见图1。

1.5 柑橘皮总黄酮的提取测定

准确称取1.00 g的干燥橘皮粉，用超声辅助石油醚脱脂脱色2 h，用蒸馏水冲洗橘皮粉至黄色消失，干燥后备用，选用不同体积分数的乙醇作为提取剂，按照不同的料液比、超声功率、提取液pH值、提取时间、提取次数，提取后以转速4 000 r/min离心20 min，取样品上清液1 mL，将体积分数60%的乙醇稀释至50 mL，再取1 mL按标准曲线制作方法进行显色反应，测定吸光度。根据芦丁标准曲线计算出显色液中总黄酮质量浓度，再按下式计算提取率：

图1 芦丁标准曲线

2 柑橘皮中总黄酮提取的影响因素

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

准确称取多份1.00 g的干燥橘皮粉，选取料液比1∶25，提取液pH值8，超声功率300 W，提取时间1 h，分别溶于乙醇体积分数50%，60%，70%，80%，90%的提取液中，研究乙醇体积分数对柑橘皮中总黄酮提取率的影响。

乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

由图2可知，乙醇体积分数为50%～70%时，提取率不断升高；而乙醇体积分数为70%～90%时，提取率逐渐降低。由于总黄酮包括黄酮苷和苷元，黄酮苷在水和乙醇中都易溶解，但苷元的水溶性较差，而70%乙醇对黄酮苷和苷元都有较好的溶解性[3]。

2.1.2 料液比对总黄酮提取率的影响

准确称取多份1.00 g的干燥橘皮粉，选取乙醇体积分数70%，提取液pH值8，超声功率300 W，提取时间1 h，料液比1∶15，1∶25，1∶35，1∶40，研究料液比对柑橘皮中总黄酮提取率的影响。

料液比对总黄酮提取率的影响见图3。

由图3可知，料液比为1∶15～1∶40时，总黄酮的提取率逐渐增加，到1∶40时达到最大；但据资料研究表明，料液比由1∶25～1∶40时，总黄酮的提取率增加缓慢[4]。料液比大，有利于溶解、扩散，但回收浓缩成本高。综合考虑，提取柑橘皮中黄酮类物质以料液比1∶25较为适宜。

2.1.3 提取液pH值对总黄酮提取率的影响

准确称取多份1.00 g的干燥橘皮粉，选取乙醇体积分数70%，料液比1∶25，超声功率300 W，提取时间1 h，分别调节提取液pH值为5，6，7，8，9，研究提取液pH值对柑橘皮中总黄酮提取率的影响。

提取液pH值对总黄酮提取率的影响见图4。

由图4可知，提取液pH值为5～8时，总黄酮提取率提高，由于黄酮pH值为8～9时，其酚羟基易离子化，水溶性增强，有利于乙醇提取柑橘皮中的总黄酮。

2.1.4 提取时间对总黄酮提取率的影响

准确称取多份1.00 g的干燥橘皮粉，选取乙醇体积分数70%，料液比1∶25，超声功率300 W，提取液pH值8，分别设定提取时间为45，60，75，90 min，研究提取时间对总黄酮提取率的影响。

提取时间对总黄酮提取率的影响见图5。

图3 料液比对总黄酮提取率的影响

图4 提取液pH值对总黄酮提取率的影响

图5 提取时间对总黄酮提取率的影响

由图5可知，提取时间为30～60 min时，总黄酮提取率增幅较大；当提取时间超过60 min，提取率基本不再变化，总黄酮已提取充分，溶质在溶液中达到了溶解平衡，所以提取时间60 min较为适宜。

2.1.5 提取次数对总黄酮提取率的影响

准确称取多份1.00 g的干燥橘皮粉，选取乙醇体积分数70%，料液比1∶25，超声功率300 W，提取时间60 min，提取液pH值8，提取次数分别为1，2，3，4，5次，研究提取次数对总黄酮提取率的影响。

提取次数对总黄酮提取率的影响见图6。

图6 提取次数对总黄酮提取率的影响

由图6可知，提取次数为1～4次时，总黄酮提取率逐渐增加，再继续提取会浪费溶剂和消耗动力。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，考虑到避免了高体积分数乙醇提取出脂溶性成分而影响黄酮类物质的提取，对乙醇体积分数的选择确定在70%，而料液比（A）、提取时间（B）、提取液pH值（C）和提取次数（D）4个因素进行L9（34）正交试验[5]。

超声提取正交试验与极差分析见表1。

表1 超声提取正交试验与极差分析

由表1可知，对总黄酮提取率影响因素的大小顺序为A＞B＞D＞C，即料液比＞提取时间＞提取次数＞提取液pH值；最佳的试验工艺条件为A2B2C2D1，即料液比1∶25，提取液pH值8，提取时间60 min，提取次数3次。

2.3 验证试验

按照正交试验确定的最佳工艺条件下，使用乙醇体积分数70%作为提取液，料液比1∶25，提取液pH值8，提取时间60 min，提取次数3次，将3次测定总黄酮的提取率求平均值，得到最优提取工艺条件下总黄酮的提取率为2.68%。

3 结论与讨论

柑橘中总黄酮提取方法研究较多的有溶剂浸提法、微波提取法、酶法提取、超声波辅助提取法、超临界萃取法等[6]，试验采用超声波辅助提取，因其简便、快速和安全等优点，在植物的有效成分提取中得到了广泛应用。通过超声提取法对柑橘皮中的黄酮类化合物进行提取，设计单因素试验和正交试验，考查了超声提取的5个因素对柑橘皮中黄酮类化合物提取效果的影响，最后确定了柑橘皮中总黄酮超声提取的最佳提取工艺为乙醇体积分数70%，料液比1∶25，提取次数3次，提取液pH值8，提取时间60min，该工艺条件下总黄酮提取率达2.68%。

试验所得的总黄酮提取率较有关文献报道偏低，这可能是由于：①原料经过石油醚脱脂后再提取总黄酮，降低了总黄酮的提取率，增加此步骤的目的是柑橘皮中所含的脂溶性色素和芳香油，如采用溶剂直接提取后浓缩，脂溶性杂质混入会造成显色法测定总黄酮产生较大检测误差；②因实验室未配备可调功率、温度的超声处理器，无法考查提取温度和超声功率2个因素对总黄酮提取率的影响。在实际生产中，应考虑降低提取次数以减少时间和试剂成本，并剔除石油醚脱脂步骤来增加总黄酮提取率。

[1]Benavente Garcia O，Castillo J，Marin F R，et al.Uses and properties of citrus flavonoids[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45（12）：4 505-4 515.

[2]蒋雪蕾，刘军海，李安源.超声辅助正交试验优化提取桔皮总黄酮的工艺研究[J].广东化工，2013，40（5）：53-54.

[3]曾晖.鲜橘皮、陈皮、青皮中黄酮化合物的提取[J].中医药导报，2009，15（6）：94-97.

[4]陈凤清，张紫瑶，郑长新，等.丑橘皮总黄酮的提取工艺及抑菌活性研究[J].中国农机化学报，2017，38（1）：69-73.

[5]薛长晖.微波提取橘皮总黄酮的工艺[J].粮油加工，2010（7）：142-145

[6]秦艳，冯卫华，白卫东，等.柑橘类黄酮化合物的提取及定量分析方法研究进展[J].食品工业科技，2012，33（11）：404-406，413.◇

Study on Extraction of Total Flavonoids from Orange Peel

ZHANG Dongdong，XU Di，HONG Wei
（Department of Biology Engineering，Wuhu Institute of Technology，Wuhu，Anhui 241003，China）

Selection of ultrasonic method for extracting total flavonoids from orange peel，the extraction technologies of ultrasonic-assisted of total flavonoids from orange peel through are optimized through orthogonal test based on single factor.The result shows that the optimum conditions are as flows：ethanol concentration 70%，1∶25 of the radio of material and solvent，pH values 8，extractiing time 60 min，extraction time 3，under the conditions of total flavonoids extraction rate of 2.68%.

orange peel；flavonoids；ultrasonic extraction；impact factors

TQ461

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.028

1671-9646（2017）05b-0001-03

2017-04-26

安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目（KJ2016A765）；安徽省高校优秀拔尖人才培育资助项目（GXFX2017245）；安徽省省级质量工程资助项目（2016MOOC328）。

张冬冬（1983—），男，硕士，讲师，研究方向为生化检测。