长链非编码RNA HOTAIR对非小细胞肺癌迁移与侵袭能力的影响

彭 卓,李 维,牛泽群,王维霞,邬 媛,潘龙飞△

1.西安交通大学第二附属医院急诊科(西安 710004),2.西安交通大学第二附属医院呼吸内科(西安 710004)

长链非编码RNA HOTAIR对非小细胞肺癌迁移与侵袭能力的影响

彭 卓1,李 维2,牛泽群1,王维霞1,邬 媛1,潘龙飞1△

1.西安交通大学第二附属医院急诊科(西安 710004),2.西安交通大学第二附属医院呼吸内科(西安 710004)

目的：探讨非小细胞肺癌组织中长链非编码RNA HOTAIR的表达情况及其对细胞侵袭与迁移水平的作用。方法：利用定量的反转录PCR技术检测50例非小细胞肺癌组织中LncRNA HOTAIR的表达，然后通过过表达技术与RNA干扰技术研究LncRNA HOTAIR的主要功能。再对其pcDNA-HOTAIR与si-HOTAIR进行转染调控LncRNA HOTAIR的表达，设置空白载体与阴性对照组,应用反转录PCR进行转染效率的定量检测。然后分别实施MTT与Transwell两种方法来判断LncRNA HOTAIR的异常表达对非小细胞肺癌细胞活性的干预作用。结果：在非小细胞肺癌组织中LncRNA HOTAIR的相对表达水平是(24.50±7.43)。LncRNA HOTAIR在SPC-A1和SK-MES-1两种细胞中的相对表达水平比在正常的支气管上皮细胞中更高，在A549细胞中的相对表达水平比在正常的支气管上皮细胞中更低。而经2 d的转染 siRNA后，LncRNA HOTAIR 在A549与SPC-A1两种细胞中的表达水平降低；pcDNA3. 1-HOTAIR后，LncRNA HOTAIR在A549细胞中的表达水平升高。利用RNA干扰技术阻碍HOTAIR的表达水平，不能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。而利用si-HOTAIR的转染降低LncRNA HOTAIR的表达水平能够阻碍癌细胞的迁移与侵袭作用(P<0.05)；而LncRNA HOTAIR的过度表达能够明显推动癌细胞的迁移与侵袭作用(P<0.05)。结论：HOTAIR在非小细胞肺癌中的高水平异常表达，能够提高非小细胞肺癌细胞迁移与侵袭水平，可能和患者的不良预后有联系。

肺癌是全球发病率、病死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占80%[1]，其早期缺乏典型临床症状，大多数患者就诊时已为晚期，预后不良。目前普遍认为NSCLC治疗失败的主要原因是肿瘤细胞的侵袭和转移，转移机制复杂不明确。因此早期判断转移对NSCLC 的治疗及预后甚为关键。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA,不能编码蛋白质,但研究表明其能够在染色质修饰、转录或转录后等水平调控下游基因的表达,进而参与细胞增殖、凋亡及侵袭等多种生物学过程,并在肿瘤等疾病的发生发展过程中扮演重要的角色[2-4]。因此,研究LncRNA和NSCLC发生、发展的关系,从这一新的角度阐明LncRNA参与NSCLC侵袭转移的分子调控机制具有重要临床意义。本文拟通过实验研究HOX基因的反义基因间RNA(HOTAIR)在NSCLC组织中的表达及对NSCLC细胞增殖、迁移与侵袭水平的影响。

材料与方法

1 材 料 选取2013年1月至2015年12月我院50例非小细胞肺癌患者的癌组织与临近癌旁组织标本。全部病人手术前均未接受过化疗或分子靶向治疗。参与本实验患者均签署知情同意书。标本在采集后立即置于液氮中冻存。研究中使用的细胞系有非小细胞肺癌腺癌A549、SPC-A1，鳞癌细胞系SK-MES-1与人类正常支气管上皮细胞系 16HBE四种[5]。使用的试剂有RPMI 1640 和DMEM培养基、胎牛血清(10%)、Trizol、pcDNA3.1与阴性对照siRNA、Lipofectamine 2000均来自美国的Invitrogen公司,Matrigel 与结晶紫(0.1%)均来自Sigma-Aldrich，SYBR Premix Ex Taq以及 PrimeScript均来自日本 Takara公司,MTT 和Mi-diprep 试剂盒均来自德国Qiagen公司,倒置显微镜来自日本Olympus。

2 实验方法 采集的细胞在37 ℃与5%的CO2的条件下培养,培养基中需添加10%的胎牛血清、青霉素与链霉素[6]，然后构建表达载体,将pcDNA3.1-HOTAIR 转染到A549中,把si-HOTAIR转染到A549与SPC-A1中,然后对细胞进行培养。设置空白载体与阴性对照组(si-NC)，在2 d后采用Trizol试剂提取PCR,再应用定量的反转录PCR以PrimeScript与 SYBR Premix Ex Taq试剂进行转染效率的定量检测[7]。然后分别实施MTT与Transwell两种方法来判断LncRNA HOTAIR的异常表达对非小细胞肺癌细胞活性的干预作用,其中,MTT 法是通过酶标仪来判断细胞增殖的情况，而Transwell实验是通过倒置显微镜来观察细胞的迁移与侵袭情况。

结 果

1 非小细胞肺癌组织中LncRNA HOTAIR 表达水平 见表1。在非小细胞肺癌组织中LncRNA HOTAIR的相对表达水平(24.50±7.43)。LncRNA HOTAIR 在SPC-A1和SK-MES-1两种细胞中的相对表达水平比在正常的支气管上皮细胞中更高(P<0.05)；在A549细胞中的相对表达水平比在正常的支气管上皮细胞中更低(P<0.05)。

表1 HOTAIR 在不同细胞系中的表达情况

注：与16HBE组比较,△P<0.05

2 非小细胞肺癌细胞中外源性LncRNA HOTAIR 表达水平 见表2和图1。经2 d的转染siRNA后，LncRNA HOTAIR在A549与SPC-A1两种细胞中的表达水平比在转染之前更低(P<0.05)。经2 d的转染pcDNA3. 1-HOTAIR后，RNA HOTAIR在A549细胞中的表达水平比转染之前更高(P<0.05)。

表2 转染后HOTAIR 的表达情况

注：si-NC为阴性对照组

图1 转染后pc HOTAIR 的表达情况

3 HOTAIR表达水平对细胞增殖的作用 见图2。利用RNA干扰技术阻碍HOTAIR的表达水平，不能抑制NSCLC细胞的增殖。转染 pcDNA-HOTAIR促使HOTAIR的表达能够抑制NSCLC细胞的增殖。在SPC-A1细胞中,各时间段si-HOTAIR的吸光值与si-NC差异无统计学意义(P>0.05)，在24、48、72、96 h si-HOTAIR的吸光值分别是1.3、2.3、3.8和5.0，si-NC的吸光值分别是1.2、2.4、3.9和4.9。在 A549细胞中，各时间段si-HOTAIR的吸光值明显低于si-NC(P<0.05)。在24、48、72、96 h,si-HOTAIR的吸光值分别是1.0、2.7、3.8和5.8，si-NC的吸光值分别是1.5、3.1、4.2和6.3。

图2 转染si-HOTAIR后非小细胞肺癌组织中HOTAIR的表达情况

4 HOTAIR表达水平对细胞迁移与侵袭的作用 见图3。利用 si-HOTAIR的转染降低LncRNA HOTAIR的表达水平能够阻碍癌细胞的迁移与侵袭作用(P<0.01)，在迁移实验中，转染si-HOTAIR的细胞表达数为202，而在阴性对照组si-NC的细胞表达数为484；在侵袭实验中，转染si-HOTAIR的细胞表达数为121，而在阴性对照组si-NC的细胞表达数为388。而LncRNA HOTAIR的过度表达能够明显推动癌细胞的迁移与侵袭作用(P<0.01)，在迁移实验中，转染pcDNA-HOTAIR的细胞表达数为503，空白载体组pcDNA- NC的细胞表达数为282；在侵袭实验中，转染pcDNA-HOTAIR的细胞表达数为193，空白载体组pcDNA- NC的细胞表达数为492。

图3 转染后非小细胞肺癌组织中细胞迁移与侵袭情况

讨 论

NSCLC是一种死亡率非常高的恶性肿瘤，5年生存率仅为17%[8]。该病的发生涉及到癌基因与原癌基因的突变、DNA甲基化的变化与非编码RNA表达的异常等[9]。NSCLC患者在发病早期诊断率较低，原因是NSCLC细胞非常容易发生转移，而明确NSCLC细胞转移的发生机制对于在该病早期提高诊断率、改善预后具有非常重要的意义。以往的研究表明，长链非编码RNA能够在肿瘤的形成和发展过程中发挥重要的调控功能，Nie等[10]研究表明，HOTAIR在胰腺癌中呈现出高表达的状态，其能够经组蛋白的甲基化以阻碍多类抑癌基因的相对表达水平以便于参与肿瘤的病情发展进程，其可成为反应肿瘤预后的相关因子。Alves 等[11]研究表明，在结肠癌和乳腺癌的病人中，HOTAIR能够经由调节各类信号的作用机制，参加上皮间质的转化作用，从而保证肿瘤干细胞的特质。可见HOTAIR在多种肿瘤的发生发展中起到一定的作用，这为研究HOTAIR在NSCLC发展变化中的作用机制奠定了基础。本文通过实验检测 HOTAIR在NSCLC中的表达情况，并分析HOTAIR的异常表达对NSCLC增殖、迁移与侵袭的作用。HOTAIR在NSCLC组织中表达水平高，在SPC-A1与 SK-MES-1细胞中相对表达水平较高，而在A549细胞中相对表达水平较低。经靶向敲除HOTAIR的方法阻碍HOTAIR的表达对NSCLC细胞的增殖没有影响，而降低HOTAIR 的表达水平能够阻碍细胞的迁移与侵袭，HOTAIR的过度表达能够明显推动癌细胞的迁移与侵袭作用，而侵袭与迁移作用的强弱能够直接影响肿瘤的发展进程。

综上所述，LncRNA HOTAIR在NSCLC中高水平的异常表达，能够提高NSCLC细胞的迁移与侵袭水平，这表明其可能和患者的不良预后相关，为今后在分子水平进一步研究抑制NSCLC的治疗手段提供了依据。

[1] 许有涛,邱满堂,王 洁,等.长链非编码RNA相关转录子2在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J].中华实验外科杂志,2015,32(5):1075-1077.

[2] Horiuchi A, Hayashi T, Kikuchi N,etal. Hypoxia upregulates ovarian cancer invasiveness via the binding of HIF-1alpha to a ypoxia-induced,methylation free hypoxia response element (HRE) of S100A4 gene[J]. Int Jcancer,2012,131(8):1755-1767.

[3] Shi X,Sun M,Liu H,etal.Long non-coding RNas： a newfrontier in the study of human diseases[J].Cancer Lett,2013,339(2)：159-166．

[4] Lipovich L, Johnson R, Lin CY. Macro RNA underdogs in a micro RNA world:evolutionary, regulatory, and biomedical significance of mammalian long non-protein-coding RNA[J]. Biochim Biophys Acta,2010,1799：597-615.

[5] 王 俊,彭珍子,董叶萍,等.长链非编码RNA C6orf176两个转录本在非小细胞肺癌中的表达及意义[J].中南大学学报：医学版,2016,41(6)：560-565.

[6] 张学军,汤虎成,刘 飞,等.长链非编码RNA Gas5在非小细胞肺癌中的表达及意义[J].临床肺科杂志,2015, 20(2)：239-241,242.

[7] 孙士玲,杨丽萍,张书林,等.巢式RT-PCR技术检测肺癌76例微量癌细胞转移分析[J].陕西医学杂志,2004,33(7)：583-585,594.

[8] Siegel R, NaishadhamD, Jemal A. Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1)：11-30．

[9] 张泽雨,易升明,张 岩,等.长链非编码RNA HOTAIR 在非小细胞肺癌中的表达及意义[J].临床肺科杂志,2015, 20(1)：102-104,105.

[10] Nie Y,Liu X,Qu S,etal.Long non-coding RNA HOTAIR is an independent prognostic marker for nasopharyngeal carcinoma progression and survival[J].Cancer Sci,2013,104(4)：458-464.

[11] Alves CP,Fonseca AS,Muys BR,etal.The lincRNA Hotair is required for epithelial-to-mesenchymal transition and stemness maintenance of cancer cells lines[J].Stem Cells,2013,31(12)：2827-2832．

(收稿：2016-11-15)

Influence of down-regulated long noncoding RNA HOTAIR on migration and invasion of non-small cell lung cancer cell lines

Peng Zhuo,Li Wei,Niu Zequn,et al.

Emergency Department, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710004)

Objective：To research the expression profile of long noncoding RNA HOTAIR in non-small cell lung cancer tissues,and to study its functions in NSCLC cell migration and invasion.Methods: Quantitative reverse-transcription PCR was performed to detect the relative expression of HOTAIR in 50 NSCLC tissues.To further explore its function,techniques of overexpression and RNA interference were applied．pcDNA-HOTAIR and si-HOTAIR was transfected to regulate HOTAIR expression in NSCLC cells，and the transfection efficiency was evaluated by qRT-PCR．MTT assay and Transwell assay were performed to evaluate the effect of ectopic HOTAIR expression on proliferation，migration and invasion potential of NSCLC cells.Results：The relative expression of HOTAIR in 50 cases of NSCLC tissues was(24.50±7.43)．Compared with normal bronchial epithelium cell 16HBE，there was a relatively high expression of HOTAIR in SPC-A1 and SK-MES-1 cells，and a relatively low expression in A549 cell.The HOTAIR expression was downregulated in A549 and SPC-A1 cells at two days after transfection of HOTAIR siRNA，and up-regulated in A549 cells at two days after transfection of pcDNA3. 1-HOTAIR.RNAi-mediated suppression of HOTAIR had little effect on cell proliferation,while inhibition of HOTAIR by si-HOTAIR could repress cell migration and invasion(P<0. 05); overexpression of HOTAIR could significantly promote cell migration and invasion(P<0.05).Conclusion:The high expression of HOTAIR in NSCLC can promote cell migration and invasion.It may correlates with poor prognosis in NSCLC．

Cancer,non-small cell lung RNA,long noncoding Cell migration inhibition Neoplasm metastasis

*陕西省科技攻关项目(2016YFJH2-05)

癌非小细胞,肺 RNA,长链非编码 细胞迁移抑制 肿瘤转移

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.004

△通讯作者