三氯卡班可以影响肾小管上皮细胞的屏障功能

杨峰，王京真，刘文华,#

1. 汕头大学海洋生物研究所 广东省海洋生物技术重点实验室，汕头 5150632. 钦州学院，钦州 535000

三氯卡班可以影响肾小管上皮细胞的屏障功能

杨峰1，王京真2,*，刘文华1,#

1. 汕头大学海洋生物研究所 广东省海洋生物技术重点实验室，汕头 5150632. 钦州学院，钦州 535000

三氯卡班(TCC)是一种被广泛应用于个人护理用品中的广谱型亲脂性杀菌剂，已在多种环境介质和生物体中检出。因其潜在的环境蓄积、生物累积和生物毒性效应，日益受到学者们的关注。借助TCC对NRK-52E(大鼠肾小管上皮细胞)的毒性暴露实验，通过检测细胞活力、以及与跨膜电阻和紧密连接相关的连接黏附分子1(JAM-1， junctional adhesion molecule 1)的蛋白表达水平，研究了TCC潜在的肾脏毒性效应。结果显示，10 μmol·L-1TCC处理48 h时培养细胞呈现不规则的集落；10 μmol·L-1和20 μmol·L-1TCC处理NRK-52E 24 h、48 h和72 h后可以显著抑制细胞生长；3.57 μmol·L-1TCC(生长抑制的48 h-IC20)处理NRK-52E 48 h可以显著抑制细胞间紧密连接蛋白JAM-1的表达量，并降低跨膜电阻，影响肾脏的屏障功能。本研究的结果能够为进一步揭示TCC对动物的毒害机制、评估其对动物的健康风险提供数据支持。

TCC；NRK-52E细胞；细胞毒性；屏障功能

三氯卡班(1-(4-chlorophenyl)-3-(3,4-dichlorophenyl) urea, triclocarban, TCC)是一种广泛运用于个人护理用品中的广谱型亲脂性杀菌剂[1-3]，常添加在人们日常使用的肥皂、洗面奶、沐浴露、美容化妆用品和牙膏中[4-5]。因为较大的环境输入量以及其具有环境蓄积、生物累积和生物毒性等特征，已成为目前人们最为关心的污染物之一[6]。

20世纪70年代，欧盟基于毒理动力学的研究将TCC认定为安全、无毒的杀菌剂，可添加于人们日常的护理用品中(personal care products, PCP)[7]。相比于毒性研究较为深入的三氯生(TCS)，TCC一直被认为是较好的替代剂。由此TCC的使用量急剧增加。在化妆用品中TCC的含量可达0.2%；在抗菌皂中，它的使用量一般高于1.5%；在洗涤类用品中的允许浓度最高可达2%[2]。有报道显示，TCC在美国的消耗量每年可达1百万磅[1-2]，而在中国的年消耗量可高达1 220 t[8]。随着TCC的大量使用，其在环境中的排放量逐年增加；又因其较为稳定的理化属性和较高的环境持久性(在沉积物、土壤、水和空气中的半衰期分别为540、120、60和0.75 d)[7,9]，目前已成为水环境中最常检测到的污染物之一。其在北美、欧洲和亚洲污水中的浓度可以达到μg·L-1级[9-10]，在中国五大河(辽河、海河、黄河、珠江和东江)的表层水和沉积物中的检出率为100%，而且在表层水和沉积物中的浓度高达338 ng·L-1和2 723 ng·g-1[8]，表明TCC在中国水体环境中的污染检测和风险评估已成为环境工作者所面临的重要问题之一。

环境中大量的TCC(尤其是水环境中的TCC)对人与水生动物具有潜在的危害性。最新的研究表明TCC可以通过皮肤、口腔黏膜和胃肠道被人体吸收[11-13]。特别是在一次全身洗浴中会有0.39%至0.6%(约0.54 mg)的TCC会被吸收[13]，而后约21%随尿代谢排出体外[7,13]。因此肾脏有可能成为TCC毒性作用的靶器官，对其进行毒性效应的评估具有重要价值。

连接黏附分子1(JAM-1, junctional adhesion molecule 1)是紧密连接的重要组分，它参与旁通透性、细胞极性、黏附、迁移和血管生成等重要过程[14-15]。急性肾损伤、多囊肾、肾结石[16]和肾癌[17]等多种肾疾病与紧密连接的功能紊乱有关。因此作为紧密连接重要组分的JAM-1对肾功能的正常发挥有重要作用。

目前，大多数关于TCC的研究主要集中在它的分布、生物降解和内分泌干扰等方面。TCC肾毒性的研究还未见报道。本研究通过TCC对NRK-52E细胞的毒性暴露实验，结合显微镜下的细胞形态观察，并检测细胞生长、跨上皮电阻以及与肾脏功能密切相关的JAM-1蛋白水平，首次借助体外模型证实了TCC可以改变NRK-52E的屏障功能，可为进一步开展体内实验、综合评价TCC的肾脏毒性效应提供科学支持。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。细胞培养基为DMEM，添加5%(V/V)的胎牛血清，1×双抗(100 U·mL的青霉素，100 μg·mL的链霉素)；在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。

仪器：艾本德170R二氧化碳培养箱(Eppendorf，德国)；SW-CJ-IF型净化工作台(苏州安泰)；Infinite M200 PRO酶标仪(Tecan，瑞士)。

试剂：三氯卡班(TCC，纯度≥ 99%)、二甲基亚砜(DMSO，纯度≥ 99.5%)、DMEM培养基，均购自美国Sigma；CCK-8和DCFH-DA荧光探针购自中国碧云天；胎牛血清购自美国赛默飞。

1.2 细胞形态观察

取对数生长期的NRK-52E细胞接种于12孔板中。待24 h细胞完全贴壁，吸去上清，用10 μmol·L-1TCC处理48 h。用倒置显微镜观察细胞形态。

1.3 CCK-8法测定细胞活性

取对数生长期的NRK-52E细胞，接种于96孔板。待24 h细胞完全贴壁，吸去上清，然后分别加入0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1和20 μmol·L-1的TCC暴露处理[18-21]；对照组添加等体积的体积分数为0.1%的DMSO。暴露处理24 h、48 h和72 h。每组设置6个复孔，重复3次。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培养箱中孵育1 h，用酶标仪检测在450 nm处的吸光值。

1.4 跨上皮细胞电阻检测

取对数生长期的NRK-52E细胞，接种于transwells(0.4 μm, Corning Life Sciences)，使用Millipore Millicell-ERS来测量跨膜电阻，当电阻稳定时，用3.57 μmol·L-1(20%的生长抑制效应浓度，IC20)TCC暴露处理48 h；对照组添加等体积的体积分数为0.1%的DMSO；空白组无细胞。暴露48 h，再次测量跨膜电阻，重复3次，细胞单层跨膜电阻=(实测-空白)×transwells有效膜面积，单位用Ω·cm2表示。

1.5 Western blot检测JAM-1的表达

取对数生长期的NRK-52E细胞，接种于12孔板中，待24 h细胞完全贴壁，吸去上清，用IC203.57 μmol·L-1TCC(排除高浓度TCC导致细胞死亡对实验的影响)暴露处理；对照组添加等体积的体积分数为0.1%的DMSO。暴露48 h，提取总蛋白，然后进行电泳、转膜、孵育抗体。一抗(JAM-1和GAPDH)4 ℃孵育过夜，LEC化学发光显色。

1.6 数据统计与分析

采用SSPS 21.0软件(SPSS Inc.)对实验数据进行方差分析，来检验对照组和药物暴露组之间的差异(P < 0.05表示显著差异)。

2 结果(Results)

2.1 TCC对NRK-52E细胞形态的影响

通过倒置显微镜观察发现对照组NRK-52E细胞密度相对较高，细胞边缘光滑清晰而且贴壁性好；而处理组(10 μmol·L-1TCC处理48 h时)细胞呈现不规则的集落如图1所示。

2.2 TCC对NRK-52E细胞存活率的影响

CCK-8是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的快速和灵敏的方法。如图2所示，NRK-52E在TCC作用24 h、48 h和72 h后，细胞存活率随着浓度增加而降低，10和20 μmol·L-1处理组存在显著差异(P < 0.05)，而且同一浓度下随着暴露时间的增加细胞存活率下降，呈现显著的时间-剂量效应关系。利用GraphPad Prism 5.0软件拟合计算24 h、48 h和72 h的IC50和IC20。IC50分别为18.53、14.00和11.06 μmol·L-1；IC20分别为5.31、3.57和2.54 μmol·L-1。

2.3 TCC可以影响NRK-52E的屏障功能

NRK-52E的屏障功能可以通过跨膜电阻来评估。如图3所示，3.57 μmol·L-1TCC暴露可以显著降低跨膜电阻(P < 0.05)。

图1 三氯卡班(TCC)对NRK-52E细胞形态的影响注：A为正常对照；B为10 μmol·L-1 TCC处理48 h。Fig. 1 Effect of triclocarban (TCC) on morphology of NRK-52E cellsNote: A- normal cultured； B- 10 μmol·L-1 TCC treatment for 48 h.

图2 TCC对NRK-52E细胞具有生长抑制作用Fig. 2 Triclocarban inhibits the growth of NRK-52E cells

图3 TCC对NRK-52E跨膜电阻(TER)的影响Fig. 3 TCC alters transepithelial electrical resistance (TER) in NRK-52E

2.4 TCC可以降低NRK-52E细胞基因JAM-1的蛋白表达

如图4所示，紧密连接分子JAM-1在3.57 μmol·L-1TCC处理48 h后表达量显著降低(P < 0.05)。

图4 通过Western blot检测TCC对NRK-52E细胞JAM-1表达的影响Fig. 4 Effects of TCC on the expression of JAM-1 in NRK-52E cells

3 讨论(Discussion)

TCC是一种广泛运用于个人护理用品中的广谱型亲脂性杀菌剂[1-3]，在被人体或水生动物吸收[11-12,22]并排泄出体外[7,13]的过程中可能引发毒性作用。然而目前相关TCC的毒理学研究较多集中在其内分泌干扰特性上[19]，对动物体危害的其他方面报道相对较少。因此，本研究主要通过利用NRK-52E细胞探讨了TCC对肾脏可能引起的毒性效应。

肾小管上皮细胞的屏障功能对肾发挥正常生理功能有重要作用[23]，我们通过跨膜电阻来评估肾的屏障功能，可以发现TCC(IC20的3.57 μmol·L-1)可以明显降低NRK-52E细胞跨膜电阻(P < 0.05)。有文献报道改变细胞间的紧密连接可以改变肾小管上皮的屏障功能，进而诱发肾脏疾病[23]。本研究中TCC(3.57 μmolL-1)染毒NRK-52E 48 h，可以抑制细胞间紧密连接蛋白JAM-1的表达，推测TCC可能通过抑制JAM-1的表达进而影响肾脏的屏障功能。

与此同时，细胞间的连接能促进同型细胞间的黏附而且可以转导信号内信号，这些信号可以调节细胞生长和凋亡。JAM-1是一种跨膜的紧密连接蛋白，敲除JAM-1后可以抑制细胞的生长，并显著增加细胞的凋亡[24]，这与本研究中的CCK-8实验结果相符。

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Triclocarban Alters Barrier Function in NRK-52E Cells

Yang Feng1, Wang Jingzhen2,*, Liu Wenhua1,#

1. Marine Biology Institute, Shantou University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Biotechnology, Shantou 515063, China2. Qinzhou University, Qinzhou 535000, China

24 May 2016 accepted 5 August 2016

Triclocarban (TCC) is a broad-spectrum, lipophilic, antimicrobial additive that is largely applied in a variety of personal care products (PCPs). Now, this chemical has been detected in various environmental matrices including sediments, fishes and water. Because of its potential accumulation capacity and biological toxicity, TCC is now increasingly drawing the attention of the researchers. In this study, the potential renal toxicity was evaluated using NRK-52E cells, and we analyzed cell viability, transepithelial electrical resistance (TER) and the protein levels of junctional adhesion molecule 1 (JAM-1) which is closely related to cellular tight junction. The results showed that irregular colonies occurred after exposing NRK-52E cells to 10 μmol·L-1TCC for 48 h, and the cell growth was also significantly inhibited in a dose- and time-dependent manners. Also, the TER and the protein levels of JAM-1 decreased after treatment with 3.57 μmol·L-1TCC for 48 h, implying the potential adverse effect of TCC on the barrier function of the kidney. Therefore, this study illustrated the in vitro nephrotoxicity of TCC, and the results can provide evidences for future study on toxicity mechanism of TCC and the possible health assessment on animals.

triclocarban; NRK-52E cell; cytotoxicity; barrier of kidney

国家自然科学基金(41306180，41176155)；教育部高等学校博士点科研基金项目(20134402110005)；海洋公益性行业科研专项经费项目(201405007)；广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室自主项目(2016ZC02)

杨峰(1989-)，男，硕士研究生，研究方向为分子毒理学，E-mail: yangfeng20082407@126.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: wangjingzhen-1@163.com；

10.7524/AJE.1673-5897.20160524003

2016-05-24 录用日期：2016-08-05

1673-5897(2017)2-177-05

X171.5

A

王京真(1982-)，男，博士后，研究方向为体外毒理学、生态和演化、保护生物学。

共同通讯作者简介：刘文华(1970-)，男，教授，研究方向为生态毒理学、海洋哺乳动物保护生物学。

# 共同通讯作者(Co-corresponding author)， E-mail: whliu@stu.edu.cn；

杨峰， 王京真， 刘文华. 三氯卡班可以影响肾小管上皮细胞的屏障功能[J]. 生态毒理学报，2017, 12(2): 177-181

Yang F, Wang J Z, Liu W H. Triclocarban alters barrier function in NRK-52E cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 177-181 (in Chinese)