三氯卡班对小鼠血浆内源性物质影响的代谢组学研究

周丽丽，谢文平，李海山，陈会明，于文莲，崔媛，刘伟，宋乃宁，沈国林

中国检验检疫科学研究院化学品安全研究所，北京 100123

三氯卡班对小鼠血浆内源性物质影响的代谢组学研究

周丽丽，谢文平，李海山#，陈会明，于文莲，崔媛，刘伟，宋乃宁，沈国林*

中国检验检疫科学研究院化学品安全研究所，北京 100123

三氯卡班被认定为一种新型的环境污染物，可能对动植物和人体产生危害，为探究三氯卡班的有害作用机制，选择C57BL6小鼠作为载体，利用分子生物学和报告基因方法考察了三氯卡班对肝脏的作用，同时利用代谢组学技术考察三氯卡班对血浆内源性代谢物变化的影响。结果表明，三氯卡班是核受体CAR的激活剂，可以提高肝脏CYP2b10的mRNA表达。同时血浆主要的内源性代谢物也产生了显著性变化，血浆中的脂肪酸比例都呈下降趋势，肉毒碱与乙酰肉碱的比例都呈上升趋势，花生四烯酸与肌酸的比例都呈上升趋势，这都与核受体CAR被激活密切相关，由此说明利用代谢组学技术能够全面地反映三氯卡班所造成的对机体的影响。

三氯卡班；C57BL6小鼠；激活剂；代谢组学

三氯卡班(triclocarban, TCC)是一种常用的高效广谱杀菌剂，属于药品及个人护理用品(pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)中一种，被广泛应用于纺织品、洗衣粉、除臭剂、皮肤护理品、牙膏和伤口消毒剂等产品中，起到杀菌、抑菌和除臭的作用[1]。近年来，随着人们对其环境稳定性、生物富集性以及生物毒性等性质的了解加深，TCC被认定为一种新型的环境污染物，可能对动植物和人体产生危害。据有关报告[2-4]，TCC对哺乳动物有慢性毒性，可能干扰哺乳动物繁殖以及引起人类高铁血红蛋白症。美国加州大学戴维斯分校的一项研究表明，添加在香皂中的抗菌化学物质TCC，有可能与一些小的非固醇类分子作用，从而影响固醇类受体信号系统，引发包括癌症、生殖功能障碍和发育异常等病症在内的诸多问题[5]。Chen等[5]研究了喂食三氯卡班后雄性老鼠，由睾酮控制的器官如前列腺等会异常增大，说明三氯卡班可以加强睾酮在人体细胞中的基因表达的控制，其很有可能成为一种新的动物体内内分泌干扰物质。同时Ahn等[6]研究也证实了TCC可增强雌激素受体依赖和雄激素受体依赖的基因表达，表现出一种新的内分泌干扰化合物的作用机制。Hinther等[7]对青蛙进行研究发现高浓度的TCC能影响哺乳细胞中甲状腺激素反应基因。而且TCC对哺乳动物的繁殖率及后代成活率有影响，同时对人类可能引起高铁血红蛋白症等。在提高pH和温度时，TCC的芳香胺C-N健断裂，可释放出N-羟基化代谢产物，会增强高铁血红蛋白症的发生率[4,8]。国内的李林朋等[9]研究TCC对人肝细胞(LO2)DNA的损伤效应发现在低暴露剂量(2.38 μmol·L-1)下就可以引起DNA断裂损伤，这为进一步揭示TCC对人体毒害的机制，更全面地评估TCC对人体健康的风险提供了依据。Yueh等[10]研究发现核受体组成型雄烷受体CAR在hUGT1ACar小鼠模型中可以被三氯卡班激活，同时激活CYP2b。以上研究说明了TCC长期存在于环境中对人体健康的风险在增加，文献报道小鼠和人之间同源基因有84%[11]，到现在已经有40对小鼠和人类的CYP基因被证实，所以小鼠模型是研究环境污染物对人体健康危害的理想模型，两者之间具有可比性。本研究利用小鼠作为载体结合代谢组学技术对TCC进行有效试验和安全评价来确定其长期环境暴露对人体健康的潜在危害，为其风险评估中动物实验结果外推到人提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

仪器：Thermo Q EXACTIVE高分辨质谱配有DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪(美国Thermo公司)，微量移液器(北京莱博润科生物科技有限公司)，CFX96荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，Thermo Syncronis C18 1.9 μm，2.1 mm×100 mm(美国Thermo公司)。

试剂：三氯卡班(triclocarban, TCC)，纯度≥99.0%，购自美国Sigma Aldrich试剂公司，pRL-TK海肾荧光素酶质粒购自美国Promega公司，胎牛血清和HepG2细胞培养液购自美国Invitrogen公司。甲醇、乙腈(色谱纯)购自美国Fisher公司，其他试剂为分析纯，实验用纯净水由Millipore Milli-Q A10(美国Millipore公司) 水纯化系统制备。实验所使用试剂均现配现用。

1.2 实验动物

C57BL6小鼠，体重约18～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，小鼠饲养于SPF级动物房中，实验前禁食24 h，自由饮水。

1.3 染毒实验

小鼠适应性饲养结束后，设置1个空白对照组和3个实验组，染毒剂量分别为10 mg·kg-1、30 mg·kg-1和90 mg·kg-1，每天灌胃染毒一次，连续14 d。末次染毒后，空腹，眼球静脉取血放置于预放肝素钠的离心管中，5 000 g离心10 min，取血浆冻存于-80 ℃冰箱，然后立即将小鼠脱颈椎处死，用预冷的生理盐水冲洗肝脏，冻存于-80 ℃冰箱。

1.4 RT-qPCR测定肝脏CYP2b10的mRNA表达水平

将肝组织块在液氮中研磨碎，加入trizol裂解，提取总RNA。CYP2b10和β-actin引物设计如表1，扩增程序为94 ℃、10 min，(94 ℃、15 s，60 ℃、30 s)×40 cycles。采用2-△△Ct法进行相对定量分析。

1.5 报告基因

按照文献方法构建PXR、CAR表达质粒，CYP2B6报告基因质粒[12-14]。人肝癌细胞系HepG2于37 ℃、5%二氧化碳环境中培养，培养液为含有10%胎牛血清、青霉素/链霉素的DMEM培养基。按每孔1×105个细胞的密度将人肝癌细胞HepG2培养于24孔板，在37 ℃、5%二氧化碳培养环境中过夜。更换无抗生素、含10%活性碳过滤血清的细胞培养液，加入质粒Fugene6转染试剂混合物(空质粒对照孔用空载体质粒代替)。24 h后更换培养液，在试验孔加入受试物(培养液0.1%体积)，对照孔加入等体积的二甲基亚砜(DMSO)，每个处理3个孔。作用24 h。阳性对照包括PXR特异性激活剂利福平，CAR特异性激活剂CITCO。使用双报告基因试剂盒中的裂解液裂解细胞，使用双报告基因试剂，化学发光仪检测发光信号。结果以萤火虫荧光素酶与内参照海肾荧光素酶的比值表示，每个处置为独立的3孔细胞。

1.6 高分辨质谱检测方法

色谱条件：A相为水(2 mmoL·L-1甲酸铵)，D相为乙腈；梯度洗脱(见表2)，分析时间0～18 min，进样量5 μL，流速0.25 mL·min-1。质谱条件：离子源为ESI(±)，离子源参数如下，喷雾电压为2 800 V；蒸发温度为350 ℃；鞘气为35 Arb；辅助气为10 Arb；毛细管温度为2 350 ℃；S-lens RF为50。化合物参数如下，一级全扫描(full scan)；分辨率为70 000；AGC target为1e6；Maximun TT为100 ms；扫描范围为50～750 m/z。

表1 设计引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR assay

表2 高分辨质谱检测的液相色谱梯度洗脱条件Table 2 Gradient condition for High Resolution Mass Spectrometer

1.7 多元统计分析

利用SIMCA-P+11软件计算三氯卡班给药组与对照组内源性代谢物的差异，绘制PCA和PLS-DA模型图，根据VIP>1选出具有显著性差异的内源性代谢物用于进一步分析。

1.8 代谢通路分析

我们利用MBRole网站(http://csbg.cnb.csic.es/mbrole/index.jsp)分析VIP值大于1的主要具有差异的内源性代谢物，选择P值小于0.05的作为三氯卡班影响的主要代谢通路，再利用Cytoscape中的Metscape模型(化合物与酶和基因的网络联系)构建与三氯卡班作用相关的主要内源性代谢物的代谢网络图。

1.9 统计学分析

采用SPSS12.0软件进行数据分析，试验数据用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示，数据比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)或成组t检验进行。与对照组相比，*代表P<0.05，**代表P<0.01。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 三氯卡班对小鼠肝脏CYP2b10 mRNA表达的影响

如图1，RT-qPCR检测的结果显示肝脏CYP2b10的mRNA表达随着剂量的增加而显著提高，90 mg·kg-1的作用最明显。

图1 三氯卡班对CYP2b10 mRNA表达的影响(n=5)注：*、**分别表示与对照组相比P<0.05、P<0.01。Fig. 1 Effects of triclocarban (TCC) treatment on CYP2b10 mRNA expression (n=5)Note: *P<0.05, **P<0.01, compared with the control.

2.2 三氯卡班对肝脏核受体PXR和CAR的影响

如图2，报告基因检测的结果显示三氯卡班是hCAR的激活剂，对hPXR无作用，这与小鼠肝脏CYP2b10被诱导结果一致，说明三氯卡班通过激活CAR而诱导CYP2b10的mRNA表达，虽然通过诱导酶活性可以增强其代谢外源性物质的能力，但长期CAR的活化会容易形成肝肿瘤的体内环境，导致肝脏内源性代谢物的变化[15]。

图2 三氯卡班对肝脏核受体hPXR和hCAR的影响(n=3)注：*、**分别表示与对照组相比P<0.05、P<0.01。Fig. 2 Effects of TCC treatment on liver hCAR and hPXR (n=3)Note: *P<0.05, **P<0.01, compared with the control.

2.3 内源性代谢物的鉴定

如图3C和图3D，利用精确质量数达到小数点5位的精确程度，并利用分子量和分子式确定每个内源性物质，同时在Tracefounder软件中建立内源性物质的数据库，用于定性分析样品中每个内源性物质，人工处理每个内源性物质的峰面积与相应内标峰面积，进行对比获得相对的含量比值用来进一步分析内源性物质的变化规律。

2.4 三氯卡班对小鼠血浆内源性代谢物变化的影响

利用SIMCA-P+11软件计算PCA和PLS-DA，如图4结果显示对照组与给药组个体能彻底分开，说明选择给药90 mg·kg-1小鼠血浆作为检测对象是合理的。如表3结果显示血浆中内源性代谢物VIP>1的总共有22种，其中8种内源性物质的比例是下降的，另14种存在上升趋势。这结果说明三氯卡班给药14 d后影响了小鼠体内内源性物质的代谢分泌，使它们的含量起了变化，主要变化成分是氨基酸和脂肪酸类物质。

图3 (A)一级正离子全扫描特征的血浆样品总离子流图；(B)一级负离子全扫描特征的血浆样品总离子流图；(C)利用精确质量数提取的精氨酸色谱图；(D)利用精确质量数和分子式确定色谱峰是精氨酸Fig. 3 (A) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from positive ion scanning; (B) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from the negative ion scanning; (C) Accurate mass number of chromatographic peak rendering for arginine; (D) Chromatographic peak is arginine according to the precise mass number and the formula

图4 高分辨质谱QE代谢组学数据的PLS-DA模型分析(A)和代谢组学血浆数据的PCA分析(B)Fig. 4 PLS-DA models of Q-Exactive Orbitrap-MS metabolomics data(A) and PCA score plots for comprehensive metabolomic data of plasma samples (B)

表3 主要内源性代谢物的平均变化(VIP value>1)Table 3 The average changes of main metabolites (VIP value>1)

2.5 血浆中的差异性代谢物代谢通路分析与网络构建

如表4，三氯卡班影响血浆内源性物质代谢的通路主要有8条通路，P值小于0.05，最主要的是精氨酸和脯氨酸代谢通路与ABC转运体通路。如图5，整个代谢网络包括95个nodes，116个edges，花生四烯酸与CYP450酶表达具有相关性，从表3数据显示在小鼠血浆中的花生四烯酸的比例呈上升趋势，与其相关联的CYP450酶活性也会上升，这与酶活性检测的结果一致。说明三氯卡班通过调控花生四烯酸的变化影响酶的活性。

图5 内源性代谢物的化合物与酶和基因代谢网络的分析Fig. 5 Compound-Reaction-Enzyme-Gene network analysis of endogenous metabolites

3 讨论(Discussion)

代谢组学是研究生物体自身生理病理状态和生物体对外源性物质的生化效应的有力手段，它所关注的是代谢通路中分子量小于1 000的小分子代谢物的变化。它不仅研究代谢产物浓度的变化，还可以研究分子动态信息，如溶液和完整组织中的分子随着时间的推移在浓度或结构上的改变。代谢组学利用波谱或光谱学方法对生物体液及组织中的代谢产物进行监测，将所得数据通过多元统计分析和模式识别方法进行分析，了解由外源性物质的作用而引起的内源性代谢产物的变化，并将这种变化与核磁共振谱或质谱的谱图模式对应起来，从而找出外源性物质作用的靶器官和作用位点，进而确定与之相关的生物标记物，确定药物或毒物作用机制，进行毒性分类和筛选。基于代谢组学这一原理，它已广泛应用于药物毒性、遗传变异、环境毒理和疾病诊断等方面。

本研究利用代谢组学技术研究三氯卡班对小鼠内源性代谢产物的影响，结合分子生物学与报告基因的实验结果显示三氯卡班是核受体CAR的激活剂，但我们预实验的结果显示三氯卡班低于10 mg·kg-1是不会引起CYP2b10的mRNA表达和酶活性的提高，说明三氯卡班的效应是与浓度相关的。但三氯卡班引起的长期CAR的活化会容易形成肝肿瘤的体内环境，导致肝脏内源性代谢物的变化，从而影响血浆中内源性物质的变化。能量代谢方面(图6)，与对照组相比，血浆中的脂肪酸比例都呈下降趋势，肉毒碱与乙酰肉碱的比例都呈上升趋势，两者的趋势正好印证了小鼠体内脂肪酸的变化规律，脂肪酸主要在肝脏中进行氧化分解，说明可能是肝脏的核受体被激活后相应的机体代谢能力增强，需要的能量也相应增多所致。氨基酸方面，与对照组相比花生四烯酸与肌酸的比例都呈上升趋势，花生四烯酸与CYP450酶的表达有相关性，随着其在血浆中的比例上升相应CYP450酶的活性也会被相应激活，这与分子生物学的结果一致。肌酸可以快速增加肌肉力量，促进新肌增长，加速疲劳恢复，提高爆发力。肌酸在人体内储存越多，力量及运动能力也越强，所以从一个侧面说明核受体CAR的激活导致机体整个生理机能的变化。本研究结果说明三氯卡班经过14 d给药后，与能量代谢、氨基酸代谢等多种代谢通路的异常相关，这都可能是核受体CAR被激活造成的结果，由此说明利用代谢组学技术能够全面地反映三氯卡班对机体所造成的影响，为对人体健康的潜在危害进行评估提供了一定的数据支持。

表4 利用MBRole的血浆代谢通路分析结果Table 4 Result for plasma pathway analysis with MBRole

图6 脂肪酸代谢通路Fig. 6 The metabolic pathways related to fatty acid metabolism

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Metabolomics Study on the Effect of Triclocarban on the Endogenous Substances in Mice Plasma

Zhou Lili, Xie Wenping, Li Haishan#, Chen Huiming, Yu Wenlian, Cui Yuan, Liu Wei, Song Naining, Shen Guolin*

Institute of Chemicals Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China

3 August 2016 accepted 24 October 2016

Triclocarban was recently identified as an environmental pollutant that may cause harm to plants, animals and humans. To explore the mechanism underlying this observation, the effects of triclocarban on the liver were investigated using molecular biology and reporter gene methods with C57BL/6 mice as the carrier. Additionally, we used metabolomics technology to investigate the impact of triclocarban on endogenous metabolites in the plasma. The results demonstrated that triclocarban activated the CAR nuclear receptor and improved hepatic CYP2b10 mRNA expression. Furthermore, endogenous plasma metabolites related to CAR nuclear receptor activation were significantly altered. Specifically, plasma aliphatic acid levels were reduced, while carnitine, acetyl carnitine, arachidonic acid and creatine concentrations were elevated. Thus, we conclude that using metabolomics technology can reveal triclocarban-induced effects on the body.

triclocarban; C57BL6 mice; activator; metabolomics

北京市自然科学基金青年基金(8164071)；质检公益项目(201510203-02，201510024)；院基本科研业务费专项基金(2015JK004，2016JK007，2017JK009，2017JK047)

周丽丽(1982-)，女，助理研究员，研究方向为化学品安全，E-mail：zhoull@aqsiqch.ac.cn

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: shengl@aqsiqch.ac.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160803001

2016-08-03 录用日期：2016-10-24

1673-5897(2017)2-147-08

X171.5

A

沈国林(1980-)，男，副研究员，主要从事化学品安全评价研究。

共同通讯作者简介：李海山(1972-)，男，研究员，主要从事毒理学研究，承担国家自然科学基金课题多项，发表SCI论文近50篇。

# 共同通讯作者(Corresponding author)， E-mail: lihs@aqsiqch.ac.cn

周丽丽, 谢文平, 李海山, 等. 三氯卡班对小鼠血浆内源性物质影响的代谢组学研究[J]. 生态毒理学报，2017, 12(2): 147-154

Zhou L L, Xie W P, Li H S, et al. Metabolomics study on the effect of triclocarban on the endogenous substances in mice plasma [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 147-154 (in Chinese)