补肾益气方对血管内皮细胞p16基因表达的影响

汤江泉+张毅

【摘要】 目的 研究补肾益气方对大鼠血管内皮细胞p16基因表达的的影响。方法 24只健康雄性SD大鼠， 随机分为中药组（补肾益气方灌胃）、黄芪组（黄芪水煎液灌胃）、生理盐水组（生理盐水灌胃）， 各8只。提取含药血清， 培养人脐静脉内皮细胞株， 采用β-半乳糖苷酶（β-gal）染色鉴定细胞衰老；流式细胞术分析细胞周期变化， 用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 方法检测p16基因的表达。结果 中药组、黄芪组G0/G1期细胞比例（63.18±1.07）、（71.73±1.32）%小于生理盐水组（79.56±2.88）%， 中药组G0/G1期细胞比例小于黄芪组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。中药组、黄芪组mRNA灰度值/β-肌动蛋白（β-actin） 灰度值比值（0.1231±0.0064）、（0.1835±0.0057）小于生理盐水组（0.5126±0.0110）， 中药组mRNA灰度值/β-actin灰度值比值小于黃芪组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。结论 补肾益气方具有延缓血管内皮细胞凋亡的作用， 其分子机制可能通过调控p16的表达使细胞周期停滞于G1 期发挥作用， 具有一定参考价值。

【关键词】 补肾益气方；血管内皮细胞；p16基因；中药

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.14.111

【Abstract】 Objective To study the impact of Bushen Yiqi prescription on p16 gene expression in vascular endothelial cells of rats. Methods A total of 24 healthy male SD rats were randomly divided into traditional Chinese medicine group （gavage of Bushen Yiqi prescription）， astragalus group （gavage of astragalus water decoction） and normal saline group （gavage of normal saline）， with 8 rats in each group. Drug-containing serum was extracted to cultivate human umbilical vein endothelial cell strain， and β- galactosidase （β-gal） dyeing was used to identify cell aging. Cell cycle changes was analyzed by flow cytometry， and p16 gene expression was detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results The traditional Chinese group and astragalus group had G0/G1 phase cell proportion as （63.18±1.07） and （71.73±1.32）%， which were less than （79.56±2.88）% in normal saline group， and the traditional Chinese group had less G0/G1 phase cell proportion than astragalus group. Their difference had statistical significance （P<0.05）. The traditional Chinese group and astragalus group had mRNA gray value/β-actin gray value ratio as （0.1231±0.0064） and （0.1835±0.0057）， which were less than （0.5126±0.0110） in normal saline group， and the traditional Chinese group had less mRNA gray value/β-actin gray value ratio than astragalus group. Their difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion Bushen Yiqi prescription plays a role in delaying vascular endothelial apoptosis， and its molecular mechanism may regulate the expression of p16 to stagnate the cell cycle at G1 phase， along with certain reference value.

【Key words】 Bushen Yiqi prescription； Vascular endothelial cells； p16 gene； Traditional Chinese medicine

相关临床资料表示， 出现动脉粥样硬化或者是心血管事件发生情况的危险因素一般为年龄增长， 而随着人们的年龄逐渐增长， 自身的机能也会逐渐的变化， 出现较多的血管衰老等现象， 而为了能够研究血管内皮细胞所实施的凋亡一般是我国对动脉粥样硬化病理生理的一种机制， 也算是出现动脉粥样硬化的因素[1， 2]。本文研究中， 作者主要观察大鼠血管内皮细胞是否会出现凋亡作用， 并将其试验结果进行统计分析， 详情如下。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 药物 补肾益气方， 药方组成：熟地20 g、山茱萸20 g、补骨脂15 g、白参15 g、枸杞子15 g、淫羊藿15 g、黄芪30 g。

1. 1. 2 试剂与仪器 流式细胞仪FACScan（BD公司， 美国）、GeneAmpPCRSystem9700 扩增仪（PE公司， 美国）、UVP凝胶成像及分析系统（UVP公司， 英国）。

1. 1. 3 实验动物 选取24只健康雄性SD大鼠， 体重为（200±10）g。

1. 1. 4 实验细胞 人脐静脉内皮细胞株（ATCC公司）。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 实验分组 将24只健康雄性SD大鼠通过动态化随机分组的方法分为中药组（补肾益气方灌胃）、黄芪组（黄芪水煎液灌胃）、生理盐水组（生理盐水灌胃）， 各8只。分别给予三组大鼠实施所在组别的治疗方法， 2次/d ， 共治疗8 d。接着取出大鼠的腹主动脉血液， 将其存放在已经高温消毒后的玻璃管里， 然后对其进行离心， 取出上清液， 接着冻存、管装， 在冰箱中保存， 进行试验时对其进行30 min灭活处理。

1. 2. 2 细胞培养 将培养基中的血清在培养箱中逐渐的进行培养， 需要时刻观察其情况， 在第2～3天需要密切对其进行换液培养， 从而进一步维持一个较为良好的生长状态。然后将三组已经采集后的血清分别放进培养液中进行培养。

1. 2. 3 细胞周期测定 将三组的细胞进行胰蛋白酶消化， 之后将其进行收集。

1. 2. 4 RT-PCR方法测定p16基因mRNA表达 对三组一般选用第56代作为衰老细胞冻存细胞进行试验。

1. 3 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 细胞周期 中药组、黄芪组G0/G1期细胞比例（63.18±1.07）、（71.73±1.32）%小于生理盐水组（79.56±2.88）%， 中药组G0/G1期细胞比例小于黄芪组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。见表1。

2. 2 p16基因表达 中药组、黄芪组mRNA灰度值/β-actin灰度值比值（0.1231±0.0064）、（0.1835±0.0057）小于生理盐水组（0.5126±0.0110）， 中药组mRNA灰度值/β-actin灰度值比值小于黄芪组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。见表2。

3 讨论

相关临床资料表示[3， 4]， 人们总会随着时间的变化导致自身机体出现衰老的现象， 而衰老也是临床各种系统性生理性的一种表现， 当患者的年龄出现逐渐增长的现象后， 其会出现较多老年疾病， 同时患者自身的心血管疾病的发生几率也会逐渐上升。

血管内皮细胞是患者自身血管内侧中较多的一种多功能细胞， 主要是能够起到促进平滑肌细胞增殖的作用， 而我国现今临床一直在采用动物实验来进行研究， 主要是通过动物实验的研究将研究的情况进行统计分析， 之后再根据研究的结果进行判断[5， 6]。

p16基因是一种细胞周期中的基本基因， 可以在一定的程度上有效抑制细胞周期蛋白的结合， 还能够使得细胞分裂逐渐出现减少的现象， 进一步抑制细胞的增值效应， 效果较佳。相关临床资料表示[7， 8]， 当p16基因出现了衰老表型， 那么就表示p16基因是一种细胞凋亡中的关键调控基因， 而p16蛋白会成为调控的中心环节， 从而在一定的程度上抑制细胞增殖且引起患者出现细胞衰老的变化情况。

随着社会的发展以及临床医学的逐渐变化， 临床上的中医药对于衰老也取得了一定的临床研究数据， 较多学者认为， 人的机体会出现衰老现象， 其主要是因为患者的中寿而尽与瘀血内阻具有一定的关系， 在患者出现肾阴虚血少的情况下， 导致阴血不足， 很有可能會出现血瘀的情况， 从而加速患者出现衰老的现象[9， 10]。

本文研究结果表示， 中药组、黄芪组G0/G1期细胞比例（63.18±1.07）、（71.73±1.32）%小于生理盐水组（79.56±2.88）%， 中药组G0/G1期细胞比例小于黄芪组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。中药组、黄芪组mRNA灰度值/β-actin灰度值比值（0.1231±0.0064）、（0.1835±0.0057）小于生理盐水组（0.5126±0.0110）， 中药组mRNA灰度值/β-actin灰度值比值小于黄芪组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。表明黄芪组能够有效延缓细胞的凋亡现象， 从而起到一定的研究效果， 同时， 从本文研究结果中还可以看出， 采用补肾益气中药远远要比黄芪的作用更加的明显。

综上所述， 补肾益气方可以有效延缓血管内皮细胞的凋亡情况， 在一定的程度上能够发挥抗动脉粥样硬化的作用， 具有一定的参考价值。

参考文献

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[6] 陈亚平， 翟桂兰. 血管内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化研究进展. 中国医学工程， 2010， 18（4）：179-180.

[7] Mcconnell BB， Starborg M， Brookes S， et al. Inhibitors of cyclin-dependent kinases induce features of replicative senescence in early passage human diploid fibroblasts. Current Biology， 1998， 8（6）：351-354.

[8] 彭勇， 张荣华， 蔡宇， 等. 补肾活血法延缓衰老的机理探讨. 陕西中医， 2004， 25（2）：142-144.

[9] 王培昌， 张建， 张宗玉， 等. 黄芪碱化合物HDTIC-1和2对衰老相关基因p16和p21表达的影响. 首都医科大学学报， 2007， 28（2）：145-149.

[10] 赵蕾， 魏晓东， 葛堂栋， 等. 黄芪血清对衰老细胞抗氧化作用及p16表达影响的研究. 黑龙江医药科学， 2006， 29（5）：4-5.

[收稿日期：2016-12-12]