慢性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血辅助性T淋巴细胞表达水平分析

侯春阳，马玉梅，刘 莉，李宗芬

慢性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血辅助性T淋巴细胞表达水平分析

侯春阳，马玉梅，刘 莉，李宗芬

目的 探讨慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B， CHB)及乙型肝炎后肝硬化(liver cirrhosis， LC)、肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)患者外周血辅助性T淋巴细胞(Th)的表达水平。方法 选择2014年1—3月建平县疾病预防控制中心传染病网络报告的HBV 34例(CHB组)及2014年1—12月在建平县疾病预防控制中心登记注册的乙型肝炎后LC 31例(乙型肝炎后LC组)和乙型肝炎后HCC 29例(乙型肝炎后HCC组)，另选择2014年1—3月参加建平县医院体格检查结论健康的志愿者30例(对照组)。所有入选患者均进行Th(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)检测并比较。结果 4组外周血Th各指标值总体比较差异均有统计学意义(P<0.05)。CHB组、乙型肝炎后LC组及乙型肝炎后HCC组外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明显低于对照组，外周血CD8+值均明显高于对照组；乙型肝炎后HCC组外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明显低于CHB组及乙型肝炎后LC组，而CD8+值明显高于CHB组及乙型肝炎后LC组；乙型肝炎后LC组外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明显低于CHB组，而CD8+值明显高于CHB组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 CHB及乙型肝炎后LC、HCC患者均存在明确外周血Th异常表达，乙型肝炎后HCC患者最为严重。

乙型肝炎,慢性；肝硬化；肝肿瘤；辅助性T淋巴细胞;外周血

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B， CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染所致，并以肝脏慢性炎症经过为主要病理改变，CHB可引起宿主体内消化系统多器官损害，部分CHB患者形成肝硬化(liver cirrhosis， LC)，甚至可以进展为肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)，严重影响患者存活寿命及生活质量。目前，多数学者认为人体内细胞免疫调节发生功能紊乱，未能有效、及时地清除HBV是发生CHB及其进展成为LC、HCC的主要原因，宿主体内细胞免疫应答状态对CHB预后及转归起主导作用，其中辅助性T淋巴细胞(Th，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)在上述过程中扮演重要角色[1-3]。国内专门观察CHB、LC及HCC患者外周血Th组间表达差异性及探讨HBV 对机体细胞免疫功能影响的研究不多。为此，我们选择2014年在辽宁省建平县疾病预防控制中心调查登记的CHB、LC及HCC患者为研究对象，观察他们外周血Th表达水平，并与对照组进行比较，现分析报告如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象 选择2014年1—3月经辽宁省建平县疾病预防控制中心传染病网络报告的HBV患者及2014年1—12月在建平县疾病预防控制中心登记注册的乙型肝炎后HCC和LC患者。将符合纳入及排除标准的CHB 34例作为CHB组，乙型肝炎后LC 31例作为乙型肝炎后LC组，乙型肝炎后HCC 29例作为乙型肝炎后HCC组。另选择2014年1—3月参加建平县医院体格检查结论健康的志愿者30例作为对照组。CHB组男21例(61.76%)，女13例(38.24%)；年龄19～62(35.71±8.40)岁。LC组男20例(64.52%)，女11例(35.48%)；年龄25～66(34.25±8.91)岁。HCC组男20例(68.97%)，女9例(31.03%)；年龄25～65(36.12±7.56)岁。对照组男19例(63.33%)，女11例(36.67%)；年龄21～69(34.90±6.78)岁。4组性别及年龄比较差异无统计学意义(F=1.229，P=0.516;χ2=0.734,P=0.982)。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：①符合HBV感染后不同临床分型疾病诊断标准。②在建平县居住5年以上。排除标准：①甲、丙、丁、戊及其他型病毒性肝炎患者；②自身免疫性疾病患者；③乙醇、血吸虫及药物等其他原因引起肝损害患者；④近1年接受抗病毒及免疫调节治疗患者；⑤接受手术及介入治疗患者。

1.3 CHB、LC及HCC诊断标准 ①CHB及LC诊断标准：选择2010年由中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会修订的“CHB防治指南[4]”中的CHB及LC诊断标准。②HCC诊断标准：选择2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的“原发性肝癌的临床诊断与分期标准[5]”中的HCC诊断标准。

1.4 外周血Th表达水平测定 采取各组空腹静脉血8 ml，高速离心后，分离血清，保存于-18℃低温冰箱待检。外周血Th (CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)表达水平测定应用美国FC-500-MPL流式细胞仪，采用四色荧光标记流式细胞技术进行检测。血液标本采集均在入选后10 d内进行。

2 结果

4组外周血Th各指标值总体比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。CHB组、乙型肝炎后LC组及乙型肝炎后HCC组外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明显低于对照组(t=2.615、P=0.012，t=2.490、P=0.017，t=2.453、P=0.018；t=2.004、P=0.041，t=2.373、P=0.022，t=2.560、P=0.014；t=2.397、P=0.019，t=2.469、P=0.018，t=2.482、P=0.017)，外周血CD8+值均明显高于对照组(t=2.452、P=0.018，t=2.516、P=0.016，t=2.172、P=0.038)，差异均具有统计学意义。乙型肝炎后HCC 组外周血CD3+、CD4+及CD4+/ CD8+值均明显低于CHB组及乙型肝炎后LC组(t=2.438、P=0.018，t=2.040、P=0.045;t=2.519、P=0.016，t=2.357、P=0.024;t=2.473、P=0.017，t=1.986、P=0.046)，而CD8+值明显高于CHB组及乙型肝炎后LC组(t=2.552、P=0.037，t=1.821、P=0.047)；乙型肝炎后LC组外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明显低于CHB组(t=1.025、P=0.049；t=1.376、P=0.048；t=1.865、P=0.046)，而CD8+值明显高于CHB组(t=1.419、P=0.048)，差异亦均具有统计学意义，见表1。

表1 CHB、乙型肝炎后LC、乙型肝炎后HCC组及对照组4组外周血辅助性T淋巴细胞各指标表达水平比较±s)

注：CHB为慢性乙型肝炎，LC为肝硬化，HCC为肝癌；与对照组比较，aP<0.05；与乙型肝炎后HCC组比较，cP<0.05；与乙型肝炎后LC组比较，eP<0.05

3 讨论

肝脏是一个易诱导产生免疫耐受的特殊器官，HBV就是引起这样细胞破坏的嗜肝脏 DNA 病毒， CHB患者的先天性免疫与后天获得性免疫都存在某些缺陷，HBV感染并不直接损伤他们的肝细胞，而是诱导宿主体内发生自身免疫反应，间接伤害肝细胞，这一类细胞免疫反应在HBV感染初期即对宿主转归和预后发挥着影响，并成为CHB后发生LC及HCC的重大影响因素[6-7]。不同个体感染 HBV后转归及结局存在显著区别，有相当比例感染人群死于CHB后LC及HCC，故探讨HBV感染后结局差异的免疫学机制成了感染科室专家和学者们的关注热点。在这里面，自然包括了Th所扮演的角色，CD4+ Th属于人体免疫应答调节中枢，协助 B细胞进行分化和产生抗体，CD4+又分为Th1和Th2两个细胞亚群，前者主要分泌干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素(IL)-2，参与迟缓型细胞免疫反应；后者主要产生IL-4、IL-5因子及合成免疫球蛋白E(IgE)，增强体液免疫应答。在HBV持续作用下，这2类细胞因子数量发生了动态波动致使Th1/Th2 失衡，这是决定CHB发生不同转归的重要免疫学病因[8-9]。目前，国内外多篇文献报道涉及了Th参与肝脏免疫及炎症反应经过内容[6-7,9]，提出了一些观点与看法。本文选择2014年1—3月辽宁省建平县疾病预防控制中心传染病网络报告的HBV患者及2014年1—12月在建平县疾病预防控制中心登记注册的乙型肝炎后LC及乙型肝炎后HCC患者为研究对象，观察不同结局HBV感染患者外周血Th表达水平变化，并与2014年1—3月在建平县医院进行体格检查的健康者进行比较，结果显示CHB组、乙型肝炎后LC组及乙型肝炎后HCC组外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明显低于对照组，外周血CD8+值均明显高于对照组；乙型肝炎后HCC组外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明显低于CHB组及乙型肝炎后LC组，而CD8+值明显高于CHB组及乙型肝炎后LC组；乙型肝炎后LC组外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值均明显低于CHB组，而CD8+值明显高于CHB组，差异均具有统计学意义。提示CHB及乙型肝炎后LC、乙型肝炎后HCC患者均存在明确外周血淋巴细胞各亚群比例失衡及Th表达异常，乙型肝炎后HCC患者最为严重。有部分学者认为，CHB、乙型肝炎后LC及乙型肝炎后HCC患者外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+值表达低下代表着这些宿主体内持续存在着HBV感染，并遭遇后者不断刺激，呈反复复制活动，并且这些Th相关指标体内表达强度不同带来了HBV感染患者不同结局[10-12]。一些国内学者应用不同方法进行类似研究，得出了与本研究较为一致结论[13-14]。

总之，在HBV感染过程中，宿主体内发生了Th表达异常，Th1/Th2失衡程度决定着CHB病程迁延程度和(或)是否转归为其他更为严重的结局(乙型肝炎后HCC和LC)。Th相关指标可作为HBV感染免疫学病因诊断、选择治疗及疗效评估的定量标识，也开辟了对这一患病群体进行分级预防及免疫治疗的新途径。

[1] Rehermann B. Pathogenesis of chronic viral hepatitis: differential roles of T cells and NK cells[J].Nat Med， 2013，19(7):859-868.

[2] 杨春，秦波.HBV感染后免疫耐受形成机制的研究进展[J].中国病原生物学杂志，2013，8(11)：1033-1035.

[3] 王晓琼，张国庆，刘中芹，等.山东省寿光市乙型肝炎、乙型肝炎相关肝硬化及肝癌流行趋势分析[J].疾病预防控制通报，2015,10(4):46-48,91

[4] 中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中国病毒病杂志，2011，1(1):9-23.

[5] 杨秉辉，夏景林.原发性肝癌的临床诊断与分期标准[J].中华肝脏病杂志，2001，9(6):324.

[6] Kennedy P T, Sandalova E, Jo J,etal. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B[J].Gastroenterology, 2012,143(3):637-645.

[7] 张敏，杨丽莎，彭德珍，等.慢性 HBV 感染不同免疫状态及乙肝肝硬化外周血T、B细胞亚群和NK细胞的变化及意义[J].实用医学杂志，2014，30(20)：3233-3236.

[8] Li J， Han Y， Jin K，etal. Dynamic changes of cytotoxic t lymphocytes (ctls), natural killer (nk) cells, and natural killer t (nkt) cells in patients with acute hepatitis b infection[J].Virol J， 2011，8(2):199.

[9] Dimitropoulou D， Karakantza M， Tsamandas A C，etal. T-lymphocyte subsets in peripheral blood and liver tissue of patients with chronic hepatitis B and C[J].In Vivo， 2011，25(5):833-840.

[10]叶玲丽，郑加勇，方深慧，等.慢性乙肝患者外周血免疫活性淋巴细胞与病毒载量及肝细胞损伤程度的关系[J].实用医学杂志，2009，25(6)：892-894.

[11]Liu C， Wang Y M， Fan K. Epidemiological and clinical features of hepatitis B virus related liver failure in China[J].WorId J Gastroenterol， 2011，17(25):3054-3059.

[12]Lopes A R， Ellam P， Das A，etal. Bim-mediated deletion of antigen specific CD8 T cells in patients unable to control HBV infection[J].J Clin Invest, 2008,118(5):1835-1845.

[13]刘宁，徐杰，刘金花，等.慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化、乙肝肝癌患者 Th1/Th2 型细胞因子水平变化研究[J].胃肠病学和肝病学杂志，2014，23(2):158-161.

[14]梁劲松，邓鑫，文彬，等.不同临床类型乙型病毒性肝炎患者淋巴细胞亚群的差异性分析[J].医学研究杂志，2015，44(2)：75-77.

Expression Levels of Helper Lymphocyte T in Peripheral Blood of Patients with Chronic Hepatitis B, Liver Cirrhosis after Hepatitis B and Hepatocellular Carcinoma

HOU Chun-yang1, MA Yu-mei1, LIU Li2, LI Zong-fen3

(1. The Second Department of Infection, the Sixth People Hospital of Shenyang, Shenyang 110006, China; 2. Center for Disease Prevention and Control of Liaoning Province, 110005 Shenyang, China; 3. Center for Disease Prevention and Control of Jianping County, Jianping, Liaoning 122400, China)

Objective To investigate expression levels of helper T lymphocyte (Th) in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B (CHB), liver cirrhosis (LC) after hepatitis B infection and hepatocellular carcinoma (HCC). Methods A total of 34 hepatitis B virus (HBV) patients (CHB group) reported in legal infectious diseases network of Jianping County from January to March in 2014, 31 LC patients after hepatitis B infection (LC group) registered from January to December 2014, 29 HCC patients after hepatitis B infection (HCC group) registered in disease prevention and control center of Jianping County from January to March in 2014 and 30 healthy people taking physical examination from January to March in 2014 (control group) were recruited in this study. Detections of T cells (CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/ CD8+) were performed for all the groups. Results There were significant differences in Th index values in peripheral blood in the four groups (P<0.05). Values of CD3+, CD4+ and CD4+/CD8+ in peripheral blood were significantly lower, while CD8+ values in peripheral blood were significantly higher in CHB, LC and HCC groups than those in control group; values of CD3+, CD4+ and CD4+/ CD8+ in peripheral blood were significantly lower, while CD8+ value was significantly higher in HCC group than those in CHB and LC groups; values of CD3+, CD4+ and CD4+/ CD8+ in peripheral blood was significantly lower, while CD8+ value was significantly higher in LC group than those in CHB group (P<0.05). Conclusion Abnormal expression of Th in peripheral blood can be found in patients with CHB, LC after hepatitis B infection and HCC after hepatitis B infection, and HCC patients after hepatitis B infection are especially severe.

Hepatitis B, chronic; Liver cirrhosis; Liver neoplasms; Helper T cells; Peripheral blood

辽宁省科技惠民计划专项资助项目(2013GS210102)

110006 沈阳，沈阳市第六人民医院感染二科病房(侯春阳、马玉梅)；110005 沈阳，辽宁省疾病预防控制中心(刘莉)；122400 辽宁 建平，建平县疾病预防控制中心(李宗芬)

R512.62；R575.2；R735.7

A

1002-3429(2017)05-0098-04

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.05.030

2017-02-11 修回时间：2017-03-10)