双波法测定烟草淀粉组分含量的前处理改进

杨胜男，牛德新，张洪映，连文力，张权，张晓阳，杨新士，崔 红

(1.河南农业大学烟草学院 河南 郑州 450002; 2.山东中烟工业有限责任公司青州卷烟厂 山东 青州 262500； 3.江西省赣州市烟草公司石城分公司 江西 赣州 341000)

双波法测定烟草淀粉组分含量的前处理改进

杨胜男1，牛德新1，张洪映1，连文力1，张权2，张晓阳2，杨新士3，崔 红1

(1.河南农业大学烟草学院 河南 郑州 450002; 2.山东中烟工业有限责任公司青州卷烟厂 山东 青州 262500； 3.江西省赣州市烟草公司石城分公司 江西 赣州 341000)

为改进双波长分光光度计法测定烟草淀粉组分的前处理，参照其他作物淀粉组分的测定方法，结合烟草淀粉的特殊来源，借助索氏提取器将脂肪、色素、糖类等对淀粉测定有影响的物质除去，然后对样品中淀粉组分含量进行测定。结果表明，前处理改进后所得样品的重复性试验相对偏差小，待测样品溶液稳定性良好；加标样直链淀粉的平均回收率为103.71%。改进后的前处理方法操作便捷，适用于烟草制品批量检测。

烟草；淀粉组分；双波长分光光度法；前处理改进

淀粉是烟草生长过程中重要的碳水化合物。烤后烟叶中的淀粉影响燃烧速度和燃吸安全性，同时产生焦糊气味，对烟气产生不良影响，淀粉含量已成为烟草品质评价的重要指标[1]。淀粉的降解除了与烘烤过程中的温湿度条件有关之外，也与淀粉本身的结构组成有关，因此，相对于淀粉总量，研究淀粉积累过程中组分的变化更具意义[2,3]。测定淀粉含量的常用方法有比色法、酶解法、酸解法和旋光法等，最为普遍的是碘比色法。直链淀粉与碘生成深蓝色复合物，支链淀粉与碘生成紫红-棕红色复合物，在同一波长处两者均有吸收，而双波长法正好消除了两类淀粉吸收背景的相互影响，减少两者引起的误差，大幅度提高测定的准确度[4-6]。目前利用双波法对淀粉组分的测定主要集中在小麦、水稻等禾本科作物上，烟草淀粉组分含量的测定报道较少。烟叶淀粉含量较少，烤后烟叶淀粉含量更少；同时，叶片淀粉中含有脂质、色素等较淀粉作物更多的影响因素，因此，烟草淀粉组分的测定更为麻烦，样品前处理成为是测定组分含量的关键。通过本试验的探索，以期为烟草中直链淀粉的测定提供一条更为简便快速，适用于大批量的样品分析的途径，同时为研究淀粉组分与淀粉降解、烟叶品质的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烟叶品种K 326，由河南农业大学烟草栽培生理生化研究基地提供。直链淀粉、支链淀粉标准样品(购于美国Sigma公司，来自马铃薯)；无水乙醇、丙酮、石油醚、KI、KOH、碘和盐酸(均为市售A.R.)。直链淀粉、支链淀粉得标准溶液及碘液的制备参照王文超等[7]的方法。80%乙醇-氯化钠饱和溶液：称取64 g氯化钠，溶于200 mL水中，加入800 mL无水乙醇，溶解，静置待溶液澄清后过滤。

UV-2550紫外可见分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)，HHS-21-4数显电热恒温水浴锅(上海百典仪器设备有限公司)，FA1004N电子分析天平(感量：0.000 1 g，上海赛德利思精密仪器仪表有限公司)，SXT-06索氏脂肪抽提器(杭州汇尔仪器设备有限公司)；PHS-3CT型酸度计(上海正举自动化仪表有限公司)；DRGF-026电热鼓风干燥箱(吴江品格烘箱电炉制造有限公司)；容量瓶(50，100 mL)和吸量管(0.5，2.0和5.0 mL)(成都昌元玻璃制品有限公司)；滤纸(脱脂，中速)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验原理 根据双波长比色原理[8]，如果溶液中某溶质在2个波长下均有吸收，则2个波长的吸收差值与溶质浓度呈正比。两类淀粉的标准溶液分别与碘起显色反应，按照全波长吸收曲线确定最大吸收波长和参比波长，对含有直链淀粉和支链淀粉的未知样品，与碘显色后，在选定的波长处进行4次比色，然后利用标准曲线即可分别求出样品中两类淀粉的含量。

1.2.2 直链淀粉和支链淀粉的标准曲线 分别吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL的直链淀粉标准样品溶液于50 mL三角瓶中，各加入蒸馏水30 mL，用0.1 mol·L-1盐酸调节pH值至3.0，再加碘溶液0.5 mL，移入容量瓶并用蒸馏水定容至50 mL混匀。静置15 min后，以KI-I2水溶液为空白对照，在直链淀粉的最大波长λ1和参比波长λ2下分别测定吸收值Aλ1和Aλ2，即可得到双波长下直链淀粉吸收度差值ΔA直= |Aλ1-Aλ2|。以直链淀粉质量浓度(mg·L-1)为横坐标，ΔA直为纵坐标，绘制双波长测定直链淀粉的线性标准曲线。支链淀粉标准曲线的确定参照直链淀粉。

1.2.3 样品前处理 目前国家标准或者行业标准中并没有对烟草淀粉组分进行准确测定的方法，所检测到的文献中大多数是小麦、水稻等禾本科作物，因此，参照禾本科作物的淀粉组分测定方法进行前处理。前处理中主要借助索氏抽提器除去对淀粉组分测定有影响的其他物质，相对来讲方法简便、快捷。

烟叶样品干燥后用研磨器研磨，过100目筛，密封保存备用。称取试样(0.500 0±0.000 5) g于滤纸包中，记录其总质量M1(g)；可提前将滤纸包放入石油醚中浸泡过夜进行预处理，后将样品移入索氏抽提器提取管中，滤纸包高度不能超过虹吸管，以所有滤纸包可浸入提取剂为准。连接好烧瓶、提取器、回流冷凝管，接通冷凝水，加热。提取器中加入石油醚(沸程30～60 ℃)，于(45±1)℃水浴中回流萃取，控制回流速度100～150滴·min-1，6～8 h后，将滤纸包取出烘干；将石油醚换做丙酮，于(60±1)℃水浴中继续加热回流约3～5 h，结束后将滤纸包取出，烘干；低温条件下将滤纸包放入80%乙醇-氯化钠饱和溶液，超声萃取20 min，重复超声步骤至上清液无色，烘干后记录滤纸包质量M2。

1.2.4 淀粉含量测定 取处理后样品0.100 0 g于烧杯中，加入1 mL无水乙醇助溶，后加入10 mL 0.5 mol·L-1KOH溶液，80 ℃水浴溶解10 min，用冰水迅速冷却后移入容量瓶，加蒸馏水定容至50 mL，混匀。取上述溶液5 mL于100 mL三角瓶中，加蒸馏水30 mL左右，用0.1 mol·L-1盐酸溶液调节pH值至3.0～3.5，加0.5 mL碘试剂，移入容量瓶加蒸馏水定容至50 mL，混匀，静置15 min后比色。

利用UV-2550紫外可见分光光度计测定样品在634 和430 nm处的吸光值。0.100 0 g处理后样品中直链淀粉含量M(mg)计算如下：

M=

未处理样品中直链淀粉所占的比例W计算如下：

2 结果与分析

2.1 双波长法测定烟草淀粉组分含量的波长确定

根据双波长分光光度法测定原理，采用作图法选定测定波长(图1)。配制30 mg·L-1直链淀粉与100 mg·L-1支链淀粉标准溶液，用紫外可见分光光度计对其进行扫描，得到直链淀粉的最大吸收波长为634 nm，按照等吸收点作图法确定测定直链淀粉含量的参比波长为430 nm。

2.2 双波长法测定烟草直链淀粉的标准曲线

通过测定不同质量浓度直链淀粉在最大吸收波长和参比波长处的吸收差值可得到直链淀粉的标准曲线(图2)。直链淀粉的标准曲线回归方程为y=0.019 7x+0.007 2，R2=0.999 3。

2.3 双波长法测定烟草淀粉组分含量的精密度评价

对同一样品进行直链淀粉含量的测定，重复5

次，计算平均值和相对标准偏差值(RSD)，结果如表1所示。表1结果表明，该方法适用于不同干燥方法处理的样品，相对于杀青样品和烤后样品，冻干样品的相对标准偏差更小；总体重复性良好，可用于直链淀粉含量测定。

1.阴性对照1.Negative

图2 直链淀粉标准曲线Fig. 2 The standard curve of amylose

样品Sample测定结果/(mg·L-1)Measurementresult平均值/(mg·L-1)Mean相对标准偏差/%Relativestandarddeviation冻干样品Lyophilizedsample18.11318.26518.57018.21518.97618.4281.902杀青样品Hightemperaturedesicca-tion16.69216.54015.98116.33716.94616.4992.212烤后样品Sampleafterbaking4.0024.3064.0524.1544.3064.1643.382

2.4 淀粉标准溶液和样品溶液稳定性检测

配制30 mg·L-1的直链淀粉标准溶液，按照样品处理方法配制检测溶液，同时加碘液，混匀，在最大吸收波长634 nm和参比波长430 nm处每隔5 min测定1次，检测吸光值的稳定性，结果见表2。由表2可知，直链淀粉标准溶液和样品溶液吸光度值在10～25 min内基本稳定；淀粉标准溶液较样品处理溶液更为稳定，测定中选择加碘液后15 min更准确。

2.5 淀粉样品溶液加标样的回收率试验

随机选择3个烟草样品中，分别添加一定量的直链淀粉标准液，按前述方法同时测定原样品和添加了标准液的烟草样品，计算回收率(表3)。回收率计算公式如下：回收率=[(测得的直链淀粉含量‐样品中直链淀粉的含量)/直链淀粉标准液加入量]×100%。由表3可知，直链淀粉的平均回收率为103.71%。表明此方法测定的直链淀粉含量具有较高的准确性。

表2 淀粉标准溶液和样品溶液不同时间的吸光度 Table 2 Absorbance of amylose standard solution and the sample solution at Different times

表3 烟草淀粉样品回收率Table 3 Recovery rate of starch of tobacco samples

3 结论与讨论

利用碘显色法测定淀粉含量时，对淀粉含量有影响的因素主要是脂肪和糖类，烟草淀粉因其来源还有色素、醌类等[9-11]。前处理中通过石油醚和丙酮分别除去脂质和色素；通过 80%乙醇-氯化钠饱和溶液去除糖类和醌类等。提前浸泡处理减少抽提时间，提高效率；利用索氏脂肪提取器可减少试剂用量，一定程度上减少了能耗。脱糖处理参照烟草行业标准[11]中连续流动法测定淀粉含量的前处理，与85%乙醇加热回流脱糖相比，样品未经过高温环境，减少了淀粉糊化的可能，并且该处理进一步除去烟草中含有的醌类。

通过对直链淀粉和支链淀粉标准溶液的全波长扫描确定，直链淀粉的最大吸收波长和参比波长分别为635 nm和433 nm，并制作直链淀粉标准曲线，表明直链淀粉在0～70 mg·L-1范围内线性关系良好，R2=0.999 3。同理可得到支链淀粉最大吸收波长和参比波长分别为545 nm和746 nm，理论上同样可得到支链淀粉的标准曲线。但在实际试验过程中，所测得的支链淀粉含量数值太大，与理论值相差甚远，因此,不采用此种方法测定支链淀粉含量。分析原因可能有三：一是样品处理的不够完全彻底，残余的杂质对支链淀粉的影响更大；二是支链淀粉本身性质的影响，直链淀粉与碘的亲和力约为200 mg·g-1，而支链淀粉约为10 mg·g-1[12]，这也应该是虽然支链淀粉含量高但加碘反应后样品溶液显示蓝色的原因；三是所用支链淀粉纯品来自马铃薯，虽与烟草同属茄科，但仍可能与烟草支链淀粉性质相差较多，标准曲线不符合烟草样品测定。此种方法虽未能测定支链淀粉含量，如若参照张峻松等[13]碘比色法测定淀粉总量的方法，可测定该前处理方法下的总淀粉含量，由总淀粉含量与直链淀粉的差值即可得支链淀粉含量。本试验旨在摸索淀粉组分测定的简便方法，支链淀粉含量仍需进一步探索。

目前关于烟草淀粉的研究较少，王文超等[7]的方法对叶片淀粉直接进行提取，所需样品质量较大。试验中样品经过研磨、匀浆、过滤等过程，多次转移，样品总量和组分都可能损耗较大。本试验主要结合小麦等谷物类淀粉含量的测定，将对淀粉含量测定有影响的物质去除，前处理过程中样品始终在滤纸包中，减少试验操作产生的误差。改进后的前处理相较于王文超等[7]通过无水乙醇、丙酮、乙醚重复洗涤的方法更简单，试剂用量少，未直接接触样品且可最大程度上除去对淀粉含量测定有影响的成分。提取烟叶中淀粉操作过程烦琐，单次试验只能处理一个样品，才能保证样品之间无影响；改进后的索氏提取器一次可处理多个样品，且样品之间互不影响，因此更适用于大批量测定。总的来讲，改进后的前处理方法更适用于冻干样品。该前处理方法简单，操作便捷，测定结果相对偏差小，回收率高，准确可靠。

目前关于烟草淀粉组分的测定方法主要是利用双波法，样品的前处理是试验的关键，既要保证烟叶中淀粉性质不发生变化，含量不降解，又要最大限度去除影响物质。对淀粉组分含量测定不论采用哪种方法都要用到标准样品作为参照，但是，由于物种来源不同，直链淀粉和支链淀粉的分子大小、聚合度、分支程度等存在差异，进而造成不同来源的淀粉的紫外光谱波形相似，但最大吸收波长和最大吸收值存在差异，因此,要更加精确测定淀粉组分的含量，应纯化和分离烟草本身的淀粉，再进行进一步的探索。烟草淀粉含量的测定既要借鉴其他淀粉来源的测定方法，又要结合烟草淀粉来源的特殊性，在进一步的试验中改进和创新。

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(责任编辑：常思敏)

Improving the pretreatment of determination of the tobacco starch components by dual wavelength spectrophotometry

YANG Shengnan1, NIU Dexin1, ZHANG Hongying1, LIAN Wenli1, ZHANG Quan2, ZHANG Xiaoyang2, YANG Xinshi3, CUI Hong1

(1.College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China； 2 .Qingzhou Cigarette Factory，China Tobacco Shandong Industial Co.,Ltd., Qingzhou 262500，China； 3.Shicheng County Tobacco Company of Jiangxi Province, Shicheng 341000, China)

To improve the pretreatment of determination of the tobacco starch components by dual wavelength spectrophotometry, we referenced the measurement methods of other crops and considered its specific source, and used Soxhlet extraction System to remove the fat, pigmentum, sugars and other substances that affect the determination of starch components, then determined the starch component content in the samples. The results showed that the relative standard deviation of the repeated test of the sample from the improved pretreatment is small and the stability of the sample solution is good. The recovery rate of added mylose was 103.71%. The improved pretreatment program is simple, and easy to operate, and the new method can be applied for analyzing plentiful samples due to its accuracy and rapidness.

tobacco; starch components；dual wavelength spectrophotometry; improved pretreatment

2016-05-13

中国烟草总公司特色优质烟叶开发重大专项(110200902045TS-01)

杨胜男(1991-)，女，河南洛阳人，硕士研究生，主要从事烟草生物技术研究。

崔 红(1966-)，女，河南郑州人，教授。

1000-2340(2017)01-0008-05

S 572

A