虾青素对红小丑鱼消化酶活性的影响

张 芬，王亚如，朱志煌，林 琪，杜 虹*

(1. 汕头大学理学院生物系，广东 汕头 515063；2．福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)

虾青素对红小丑鱼消化酶活性的影响

张 芬1，王亚如2，朱志煌2，林 琪2，杜 虹1*

(1. 汕头大学理学院生物系，广东 汕头 515063；2．福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)

本实验以初始体质量为(4.88±0.90)g、体长为(4.85±0.32)cm的红小丑鱼(Amphiprionfrenatus)为养殖对象，研究饲料中添加0(对照组)、2‰、4‰、6‰、8‰的虾青素对红小丑鱼消化酶活性的影响。本试验每组3个重复，每个重复6尾鱼，饱食投喂2次/d(投喂时间为08∶30和14∶30)，试验周期为20 d。结果表明：添加虾青素组的红小丑鱼胃肠消化酶活性均高于未添加虾青素组，当虾青素添加量为4‰时，红小丑鱼前肠蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及后肠淀粉酶活性达到最高(P<0.05)；当添加量为6‰时，其胃脂肪酶和淀粉酶活性最高(P<0.05)；当添加量为8‰时，其胃和后肠的蛋白酶以及后肠脂肪酶的活性达到最高(P<0.05)。因此，在饲料中添加4‰～8‰的虾青素能够较有效地提高红小丑鱼消化器官的消化酶活性。

红小丑鱼；虾青素；蛋白酶活力；脂肪酶活力；淀粉酶活力

消化酶是一类由消化系统分泌的具有营养消化作用的酶类。鱼类通过消化酶消化摄入的食物来获取能量和营养素。消化酶活性的变化还是指示鱼类在不同生长阶段的营养状况和生长性能的一个可靠参数[1-2]。鱼类消化酶的活性在不同组织器官也不尽相同，且饲料中的添加剂能显著影响鱼类消化酶活性[3-4]。

虾青素(Astaxanthin)，又名虾黄素、虾黄质，主要指来源于藻类、酵母菌、甲壳类动物等的类胡萝卜素含氧衍生物。虾青素因具有抗癌、抗氧化、抗强光照射及改善观赏鱼类体表着色效果等功能，而有较高的营养保健价值[5]。目前虾青素主要应用在以下几个方面[6-7]：1)抗氧化剂：医药及食品保健品；2)抗癌变预防治疗；3)防晒剂；4)眼病的治疗和预防；5)增强免疫功能：帮助老龄动物恢复免疫力；6)食品和化妆品着色剂；7)饲料添加剂。

红小丑鱼(Amphiprionfrenatus)又名番茄小丑，属雀鲷科(Pomacentridae)、海葵鱼亚科(Amphiprioninae)鱼类，其分布于印度洋和太平洋珊瑚礁海域，是重要的海水观赏鱼之一[8-9]。由于野生捕捞小丑鱼数量有限，不易进行规模化生产，于是近几年兴起了人工繁育海水观赏鱼产业，但是人工养殖的小丑鱼体色比野生品种暗淡。虾青素拌料投喂是一种调控红色系观赏鱼体色的常用方法，可以有效解决小丑鱼体色暗淡问题[10-11]。关于虾青素对鱼虾的作用研究主要集中在对其体色及免疫功能影响等方面[12-14]，而虾青素对红小丑鱼消化酶活性影响的研究尚未报道。因此，本试验以添加不同含量虾青素的饲料投喂红小丑鱼，研究其对红小丑鱼胃肠消化酶活性的影响，进而分析虾青素对红小丑鱼生长作用的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料及饲养管理

红小丑鱼幼苗(孵化后60 d)由福建省水产研究所提供，饲养试验在福建省水产研究所观赏鱼循环水养殖系统中进行。随机选取规格统一、体质健壮、食欲良好的鱼苗分别放入5个水族箱(50 cm×45 cm×38 cm)，将每个水箱用白色塑料挡板隔成3部分(3个重复)，每个隔间放6尾鱼，试验鱼的平均体质量为(4.88±0.90)g，平均体长为(4.85±0.32)cm。本试验以投喂基础饲料的0%虾青素为对照组，实验组饲料虾青素的添加量分别为2‰、4‰、6‰和8‰。养殖期间，每天饱食投喂2次(投喂时间为08∶30和14∶30)，饲养周期为20 d。饲养水箱具有封闭式循环过滤系统，每周换水1/2，饲养期间水温(26±1)℃，pH8.0～8.1，盐度30～32，氨氮含量低于0.1 mg/L，溶解氧高于5.8 mg/L。

1.2 试验饲料

基础饲料配方组成和主要营养指标见表1。在基础饲料中添加不同含量的虾青素，虾青素(德国巴斯夫)由北京中农牧扬生物技术有限公司提供。

注：1.混合维生素(mg/kg预混料)：维生素A 2500 IU，维生素D 2400 IU，维生素C 150，维生素E 30，维生素K 10，维生素B110，维生素B220，维生素B540，维生素B610，维生素B71；维生素B115，维生素B120.02，肌醇 400。2.混合矿物质(mg/kg预混料)：Zn 100，Fe 150，Cu 3，Mn 20，I 0.8，Co 0.12， Se 0.1，Mg 100。
Notes：To contain vitamin and mineral in diet added as premix(mg/kg diet):VA，2500 IU；VD，2400 IU；VC，150；VE，30；VK，10；VB1，10；VB2，20；VB5，40；VB6，10；VB7，1；VB11，5；VB12，0.02；Inositol，400；Zn，100；Fe，150；Cu，3；Mn，20；I，0.8；Co，0.12；Se，0.1；Mg，100.

1.3 样品的制备和消化酶活性测定

1.3.1 酶活测定

首先在冰盘中对所有实验活鱼进行解剖，取出胃、前肠和后肠(剥除多余的脂肪和结缔组织)，称重，并按照实验分组分装于EP管中，加入其重量9倍(m/m)的PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)后，用匀浆器将样品组织充分匀浆，然后离心20 min(3 500 r/min)，收集上清液。

在酶标包被孔板上设置空白孔、标准品孔和样本孔。标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL(样品最终5倍稀释)，轻轻晃动混匀；除空白孔外，每孔加入酶标试剂100 μL，用封板膜封板后置37℃温育60 min，小心揭掉封板膜，弃去液体，然后甩干；将浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后加满每个酶标孔，静置30 s后弃去洗涤液，如此重复5次，晾干；再往每孔中加入50 μL显色剂A，之后继续加入50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min；最后向每孔加入50 μL终止液，终止反应(此时蓝色立转为黄色)；以空白孔调0，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15 min以内进行。酶标包被孔板由上海酶联生物试剂公司提供。

1.3.2 酶活计算

用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。酶活力(IU/L)=(A×K-B)×N，其中A为吸光度；K为回归方程斜率；B为截距；N为稀释倍数。

1.4 数据统计和分析

将所有试验数据用Excel 2010及SPSS 17.0进行分析处理用(mean±SD)表示。利用SPSS软件进行单因素方差分析，结合Duncan’s法进行多重比较，差异显著水平为P<0.05。

2 结果

2.1 饲料中虾青素对红小丑鱼蛋白酶活性的影响

如图1所示，投喂虾青素实验组红小丑鱼的胃和肠道蛋白酶活性相比对照组都有所提高。当虾青素添加量为8‰时，胃蛋白酶活性达到最高(P<0.05)；红小丑鱼前肠蛋白酶的活性随饲料中虾青素含量的增加呈先升高后降低的趋势，当虾青素添加量为4‰时，前肠蛋白酶活性达到最高(P<0.05)；后肠蛋白酶活性随饲料中虾青素含量的增加先升高后降低，当添加量为8‰时，后肠蛋白酶活性最高(P<0.05)。

2.2 饲料中虾青素对红小丑鱼脂肪酶活性的影响

如图2所示，红小丑鱼胃和前肠脂肪酶活性随饲料中虾青素含量的增加呈现先升高后降低的趋势；后肠脂肪酶活性随饲料中虾青素含量的增加而升高。当添加量为6‰时，胃脂肪酶活性最高(P<0.05)；当添加量为4‰时，前肠脂肪酶活性最高(P<0.05)；当添加量为8‰时，后肠脂肪酶活性最高(P<0.05)。

2.3 饲料中虾青素对红小丑鱼淀粉酶活性的影响

如图3所示，随饲料中虾青素含量的增加，红小丑鱼胃、前肠和后肠淀粉酶活性均呈现先升高后降低的趋势。当添加量为6‰时，胃淀粉酶活性最高(P<0.05)；当添加量为4‰时，前肠和中肠淀粉酶活性最高(P<0.05)。

3 讨论

虾青素不仅具有良好的抗氧化、抗衰老以及抗癌作用，还能够促进水产动物的生长繁殖，因此被广泛应用于药品、保健品、化妆品和水产动物饲料等领域[12-14]。

虾青素的抗氧化性能主要体现在其能清除生物体内的有害自由基。生物体在代谢过程中会产生活性氧自由基，其未成对的电子化学性质活泼，可破坏生物膜上的多元不饱和脂肪酸，导致生物膜通透性改变；自由基还能够与蛋白质连接，致使蛋白质变性或结构破坏；另外自由基还可以攻击核酸分子，造成基因突变等一系列的破坏，导致生物体产生病变[15-16]。而虾青素分子结构中的不饱和共轭双键及其两端紫罗酮环上的不饱和酮基可以吸引代谢过程中产生的未配对的自由基电子，消除生物体产生的有害活性代谢产物，从而避免由自由基氧化引发的癌症、白内障等多种疾病，并能防止机体老化[17]。虾青素的抗氧化、抗衰老、防癌症的功能作用早在小鼠、鱼虾体内被证实[18-19]。

此外，有研究指出在饲料中添加虾青素可以提高凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)、血鹦鹉(CichlasomacitrinellumXC.synspilum)、七彩神仙鱼(Symphysodonharaldi)等水产动物的增重率和生长率[20-22]。Gouveia等[23]使用含有天然虾青素的绿球藻(Chlorococcumsp.)和螺旋藻(Spirulinaplatensis)等喂食锦鲤(Cyprinuscarpio)和金鱼(Carassiusauratus)，发现对其生长和体形没有显著性的影响，而Amar等[24]以虹鳟(Oncorhynchusmykiss)为实验材料也得出相同的结果。但目前虾青素具体影响动物生长的机制还不清楚，出现这样不同的结论可能是由于水产动物消化道对虾青素的消化吸收、沉积能力以及代谢方式不同所引起的。

消化酶活性是反映鱼类消化机能的重要指标，添加虾青素饲养水产动物可能影响其消化酶活性[25]。消化酶活性决定着鱼类对营养物质消化和吸收的能力，其与鱼类的生长、发育和繁殖等重要生命活动直接相关[25]。影响消化道内消化酶活性的因素较多，主要有pH、温度、盐度、重金属离子、动物食性及生长阶段、饲料组成、外源消化酶、微生态制剂等[26-28]。近年来，有多种饲料添加剂(如氨基酸、酸化剂、维生素、糖萜素、中草药等)被用来促进鱼类生长、提高饲料利用率及增强鱼体抗病能力。这些添加剂的加入往往能够改变鱼类消化酶活力。目前虾青素对生物体内消化酶活性影响的研究未见报道。本实验通过在基础饲料中添加不同含量的虾青素，研究其对红小丑鱼体内的胃肠部消化酶活性的影响。实验结果表明，红小丑鱼胃肠部消化酶活性受虾青素的影响较为明显，其脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶的活性在一定的阈值内随着虾青素含量的增加而升高，且实验组的消化酶活性均高于对照组。因此，在饲料中添加虾青素能够提高红小丑鱼消化器官的消化酶活性。

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Astaxanthin on the influence of digestive enzyme activity ofAmphiprionfrenatus

ZHANGFen1，WANGYaru2，ZHUZhihuang2，LINQi2，DUHong1*

(1.Department of Biology，Shantou University，Shantou 515063，China；2.Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，Fisheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China)

Clown fish(Amphiprionfrenatus) was one of the most popular marine ornamental fish，and its market share was increasing in aquaculture industry.Astaxanthin could improve the growth rate and immune response of fish，and digestive enzyme could affect the growth performance of fish.This study analyzed the effect of dietary astaxanthin on the digestive enzyme activity of clown fish.90 juveniles of 30 days-post-hatch with the average weight and length of(4.88±0.32) g and(4.85±0.32) cm were divided into 5 groups，which was possessed of the same 3 replicates，and were fed with basal diet containing 0，2‰，4‰，6‰ and 8‰ astaxanthin for 20 days，respectively.The results indicated that dietary astaxanthin increased the digestive enzyme activities of clown fish.When dietary astaxanthin content was 4‰，the activities of anterior intestine protease，lipase，amylase and posterior intestine amylase were highest(P<0.05).When dietary astaxanthin content was 6‰，the activities of stomach lipase and amylase were highest(P<0.05).When dietary astaxanthin content was 8‰，the activities of posterior intestine protease，amylase and pepsase were highest(P<0.05).In conclusion，the digestive enzyme activities ofA.frenatuscould be effectively improved through feeding basal diet with 4‰～8‰ astaxanthin.

Amphiprionfrenatus；astaxanthin；protease；lipase；amylase

2017-04-26

小丑鱼早期性腺发育分化的研究(2016R1101005-1).

张 芬(1990-)，女，在读研究生，研究方向：观赏鱼体色研究. E-mail：fzhang15@163.com

杜 虹(1976-)，女，教授，研究方向：海洋生态学研究.E-mail：hdu@stu.edu.cn

张 芬，王亚如，朱志煌，等.虾青素对红小丑鱼消化酶活性的影响[J].渔业研究，2017，39(3)：188-194.

S917.4

A

1006-5601(2017)03-0188-07