Vasohibin-2与肝癌肝移植术后复发转移及预后的关系

罗来邦 杨 华 罗丽芳 徐志丹 罗文峰 龙成美 张友福 李新长



Vasohibin-2与肝癌肝移植术后复发转移及预后的关系

罗来邦 杨 华 罗丽芳 徐志丹 罗文峰 龙成美 张友福 李新长

目的 探讨Vasohibin-2在HCC组织中的表达及其与肝癌肝移植术后复发转移和预后的关系。方法 采用免疫组化和Western blot方法检测34例HCC组织及其PCLT中Vasohibin-2的表达。分析Vasohibin-2与HCC的结节数目、静脉浸润、肿瘤细胞分化程度和肝外转移等临床病理特征的关系；通过随访分析Vasohibin-2的表达与肝癌肝移植患者术后复发转移及预后的关系。结果 Vasohibin-2定位于细胞质，免疫组化及Western blot均显示HCC组Vasohibin-2的阳性表达率高于PCLT组，差异具有统计学意义(P<0.05)。34例HCC中Vasohibin-2蛋白表达量(196.6±31.4)高于PCLT组织中Vasohibin-2蛋白表达量(108.9±24.3)，差异具有统计学意义(P<0.05)；Vasohibin-2高表达组(n1=16)和Vasohibin-2低表达组(n2=18)在结节数目(P<0.05)、静脉浸润(P<0.05)、肿瘤细胞分化程度(P<0.05)和肝外转移(P<0.05)方面的差异具有统计学意义。随访资料分析结果显示Vasohibin-2高表达组的复发转移率高于低表达组(P<0.05)，高表达组的生存率低于低表达组(P<0.05)，差异具有统计学意义。结论 Vasohibin-2在HCC中表达上调；Vasohibin-2的表达与肝癌肝移植术后复发转移密切相关，有可能成为预测肝癌肝移植术后复发转移及预后的潜在指标，为防治肝癌肝移植术后复发转移开辟新的途径。

Vasohibin-2；肝癌；肝移植；复发转移；预后

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:370～374)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床上常见的恶性肿瘤之一，具有高度的侵袭转移性，易发生肝内外的复发转移，预后恶劣[1]。目前HCC外科治疗手段包括肝癌切除术和肝移植术，但患者术后5年生存率仅有50%左右，主要原因在于肝癌肝移植术后复发转移率仍然居高不下。

肝脏是一个血运非常丰富的脏器，而肝细胞癌之所以生长迅速，肝癌肝移植术后患者容易复发和转移，存活期短，死亡率高，原因很可能与复发肝癌新生血管丰富有关[2]。研究表明肿瘤血管内皮细胞参与了肿瘤新生血管的形成，同时也是肿瘤抗血管治疗的靶点[3]。所以肝细胞癌的新生血管生成程度可以预测肝癌患者的预后，而抑制血管生成的治疗将减少肝癌肝移植术后的复发和转移，提高肝癌肝移植患者的存活率，这将对肝癌肝移植的治疗产生重大影响。国内杭州肝癌肝移植标准[4]在国际米兰标准的基础上加入了肝癌生物学行为因素，而血管生成是决定肿瘤生物学行为的主要因素，所以从血管生成方面探讨中国肝癌肝移植标准具有重大意义。Vasohibin-2(VASH2)是近年来新发现的一个基因，属于Vasohibin家族，同源于Vasohibin-1，具有促血管生成的作用[5-6]。与VASH1不同，VASH2 高表达于骨髓起源的单核细胞中，它不依赖于VEGF的浓度调节且具有促进血管生成的作用[7]。VASH2在卵巢癌、胃癌等多种肿瘤中高表达，通过促进血管生成促进肿瘤的生长、转移[5，8-9]。

有关Vasohibin-2在肝癌肝移植中的研究尚未见报道，本研究采用免疫组化和Western blot方法检测34例HCC组织及其PCLT中Vasohibin-2的表达；分析Vasohibin-2与HCC的结节数目、静脉浸润、肿瘤细胞分化程度和肝外转移等临床病理特征的关系；通过随访分析Vasohibin-2的表达与肝癌肝移植患者术后复发转移及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

组织标本取自2011年6月至2013年6月江西省人民医院器官移植科手术切除的34例肝细胞癌组织和34例相对应的癌旁1 cm外的癌旁肝组织。 标本离体后迅速取材，一部分置入液氮速冻后转入-70 ℃超低温冰箱存放；另外一部分以10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片，用于免疫组化分析。在取材时务必注意避开坏死组织，全部病例均未接受包括肝动脉化疗栓塞术等在内的多种肿瘤治疗。34例HCC中男性30例，女性4例，年龄25～64岁，中位年龄42岁；单个结节19例，多个结节15例；有静脉浸润的20例，无静脉浸润的14例；Edmonson 分级Ⅰ～Ⅱ级的16例，Ⅲ～Ⅳ级的18例；有肝外淋巴结转移的14例，无肝外淋巴结转移的20例。标本均经病理组织学检查证实诊断。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 采用链酶素-生物素-辣根过氧化物酶(SABC)法进行免疫组织化学分析。将石蜡包埋的组织标本连续切成厚度为3～5 μm的切片，60 ℃烤片，二甲苯脱蜡15 min，依次浸泡在无水乙醇、90%乙醇、85%乙醇中各3 min，用新鲜配制的3%过氧化氢溶液消除内源性过氧化物酶的活性(15 min)。用1∶50 EDTA溶液(北京中杉金桥生物技术有限公司)在95 ℃下进行微波抗原热修复15 min，PBS溶液处理20 min后用4%胎牛血清封闭液37 ℃孵育30 min，然后滴加PBS液稀释的兔抗人vasohibin-2多克隆抗体，工作浓度为 1∶200(Rockland of America)，37 ℃孵育30 min，4 ℃过夜。羊抗兔二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)与组织切片进行二级免疫反应，滴加新鲜配置的DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司)显色剂后，显微镜下控制反应颜色，流水冲洗6 min，苏木精(北京中杉金桥生物技术有限公司)复染30 sec，流水冲洗10 min，60 ℃烤箱内烘干后中性树脂封片。以Western blot结果作为阳性对照。用PBS代替一抗作为阴性对照，结果未发现阳性免疫染色，说明一抗具有特异性。结果观察以细胞质出现棕黄或棕色颗粒作为判断阳性的标准。以Shimizizu 免疫组化标准[10]评分：在高倍镜视野下，无着色的记0分，染色面积小于1/3记1分，1/3～2/3记2分，大于2/3 记3分；染色强度浅着色记1分，中度着色记2分，深度着色记3分。两者相加得分为综合评分。得0分的判为阴性，0～2分的判为弱阳性，3～6分的判为强阳性。

1.2.2 Western-blot检测 称取刚解冻的肝细胞癌或癌旁肝组织200 mg，放入1.6 ml组织裂解液(20 mM Tris-HCL，10 mM NaCL，1 mM EDTA，1 mM MgCL2，1% NP-40，0.1% SDS，0.05% β-ME，0.08 mg/ml PMS)中匀浆，冰上孵育30 min。4 ℃，12 000 rpm/min，离心20 min，吸取上清，用BSA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce of America)测定总蛋白含量。用上样缓冲液(250 mM Tris-HCL PH=6.8，10%SDS，50% glycerol，0.5% bromophenor blue，2.5% β-mercaptoethanol)稀释蛋白样品(100 μg)，95 ℃蛋白变性5 min，冰上静置5 min，12%SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离(积层胶：电压80 V，30～40 min；分离胶：电压100 V，120～140 min)，凝胶上的蛋白在100 V电压下75 min转移至硝酸纤维膜(Millpore，0.45 μm)上。硝酸纤维膜浸泡在封闭液(1×PBS，5% W/V milk，0.1% Tween-20)中1 h。将硝酸纤维膜浸入含有多克隆兔抗人vasohibin-2(1∶500)抗体的封闭液中，37 ℃孵育1 h，4 ℃过夜。硝酸纤维膜经PBST(1×PBS，0.1% Tween-20)洗涤后，浸泡在结合有辣根过氧化酶的羊抗兔IgG溶液(1∶1 000，KPL of England)中孵育1.5 h，再经PBST洗涤后，SuperSignal发光试剂显影曝光摄片。用Quantity one软件(Bio-rad)对杂交条带进行定量分析，以蛋白条带吸光度和条带面积的乘积作为代表蛋白表达水平的计量资料。

1.3 观察指标

临床标本按取材部位不同分为HCC组(n1=34)和PCLT组(n2=34)。检测上述2组中Vasohibin-2蛋白的表达，比较组间Vasohibin-2蛋白的阳性表达率及表达水平的差异。根据Western blot结果，以34例肝细胞癌中Vasohibin-2蛋白表达量的均数X1与对应的34例癌旁肝组织中Vasohibin-2蛋白表达量的均数X2的比值：X1：X2=1.97为界，分为Vasohibin-2高表达组(n1=16)和低表达组(n2=18)。每组再根据肿瘤结节数目、有无静脉浸润、细胞分化程度和肝外转移等临床病理特征分组，形成四方表格资料，比较Vasohibin-2表达水平与HCC临床病理特征间的关系。在上述基础上，结合肝癌肝移植患者的随访资料，分析Vasohibin-2与肝癌肝移植术后复发转移及预后的关系。

1.4 统计学分析

全部数据采用SPSS 19.0统计软件包进行统计学分析，计量资料用均数±标准差表示，计量资料比较采用t检验。计数资料的组间比较采用Fisher’s 确切概率法。采用Kapan-Meier法计算肝癌肝移植患者术后复发/转移率和术后生存率，用Log-rank法比较2组术后复发/转移率和术后生存率的差异。以P≤0.05作为差异具有统计学意义的界值。

2 结果

2.1 免疫组化检测Vasohibin-2蛋白在肝细胞癌组织和癌旁肝组织中的定位和表达

免疫组化显示Vasohibin-2阳性信号为棕褐色颗粒状，定位于细胞质。HCC组织中Vasohibin-2的阳性表达率为85.3%(29/34)，PCLT中阳性表达率为11.8%(4/34)，两者差异具有统计学意义(χ2=36.78，P<0.05)。HCC组织中阳性表达强度高于癌旁肝组织，差异有统计学意义(χ2=41.04，P<0.05)(表1)。

表1 免疫组化检测Vasohibin-2在HCC与PCLT中表达强度的比较/例

2.2 Western blot检测Vasohibin-2在HCC和PCLT组织中的表达

Western blot结果显示34例HCC中Vasohibin-2蛋白的阳性率为88.2%(30/34)，相对应34例PCLT中的阳性率为14.7%(5/34)。Vasohibin-2在HCC组织中的表达率高于PCLT，差异具有统计学意义(χ2=36.79，P<0.05)。34例HCC中Vasohibin-2蛋白表达水平(196.6±31.4)高于PCLT中Vasohibin-2蛋白表达水平(108.9±24.3)，差异有统计学意义(t=12.88，P<0.05)。Vasohibin-2在HCC组织和PCLT中的表达见图1。

注：T：HCC组织，P：PCLT组织。(蛋白质印迹法，1、2、3表示组织标本)

2.3 Vasohibin-2蛋白表达与肝细胞癌临床病理学特征的关系

根据前述分组方法将34例肝细胞癌分为Vasohibin-2高表达组(n1=16)和低表达组(n2=18)。比较2组在临床病理学特征方面的差异，结果显示2组在结节数目(P=0.014)、静脉浸润(P=0.001)、肿瘤细胞分化程度(P=0.02)和肝外转移(P=0.035)方面的差异具有统计学意义(表2)。

表2 Vasohibin-2蛋白表达与肝细胞癌临床病理学特征的关系(例，%)

2.4 Vasohibin-2蛋白表达与肝癌肝移植术后复发转移及预后的关系

本组34例患者均获随访，随访时间为术后5年。Vasohibin-2高表达组的累计术后复发转移率(84.4%)高于Vasohibin-2低表达组(57.7%)(P=0.03)，Vasohibin-2高表达组的生存率(19.9%)低于Vasohibin-2低表达组(34.6%)(P=0.018)，Vasohibin-2低表达组中位生存时间(1357天)也明显长于Vasohibin-2高表达组(924天)(P=0.031)。见图2。

图2 Vasohibin-2蛋白高表达组和低表达组术后复发/转移率和生存率的比较

3 讨论

随着对肿瘤新生血管形成和肿瘤抗血管治疗的不断深入研究，目前认为正常组织的血管内皮细胞处于相对静止状态，而肿瘤组织的血管内皮细胞处于迅速增殖状态，其结构和生物学特征发生一定程度的改变[11]。这些肿瘤血管内皮细胞参与了肿瘤新生血管的形成，同时也是肿瘤抗血管治疗的靶点。

由于Vasohibin-2与血管生成因子间的密切关系和在肿瘤的侵袭转移中的重要作用，我们推测Vasohibin-2上调促进了血管生成，促进了肝癌肝移植术后侵袭转移。因此，本研究中我们首次选择肝癌肝移植的HCC组织标本研究Vasohibin-2，采用免疫组化和Western blot法检测了Vasohibin-2蛋白在34例HCC组织标本及其相对应的PCLT标本中的定位和表达，并分析其表达与肝细胞癌临床病理特征及肝癌肝移植术后复发转移、预后间的关系。

我们首先检测了34例HCC及PCLT组织中Vasohibin-2的表达。免疫组化及Western blot结果均显示HCC组中Vasohibin-2表达的阳性率明显高于PCLT组，HCC组中Vasohibin-2蛋白表达量显著高于PCLT组，差异均具有显著性(P<0.05)。这些结果与Vasohibin-2在卵巢癌、胃癌及子宫内膜癌中上调一致[5,8]。

HCC的复发转移是一个多因素和多步骤的过程，其本身的各种生物学特性，比如细胞分化程度和静脉浸润等也决定了侵袭转移潜能的不同[12]。因此，我们分析了Vasohibin-2表达水平与结节数目、静脉浸润、HCC的分化程度和肝外转移等临床病理特征之间的关系。本研究中我们观察到Vasohibin-2蛋白在分化程度低的HCC中表达要高于分化高者(P<0.05)，HCC中Vasohibin-2表达水平越高，越容易出现静脉浸润(P<0.05)、肝外转移(P<0.05)和多个结节(P<0.05)。这一结果显示Vasohibin-2与HCC的侵袭转移密切相关。

前述研究结果提示Vasohibin-2的表达水平与HCC的侵袭转移相关，也就有可能影响肝癌肝移植术后的复发转移及预后。因此，我们探讨了Vasohibin-2的表达对肝癌肝移植患者术后复发转移及预后的预测作用。我们将34例HCC标本分为Vasohibin-2高表达组(n1=16)和低表达组(n2=18)，结合临床随访资料进行Kapan-Meier分析和Log-rank检验后，我们发现Vasohibin-2高表达组复发率显著高于低表达组(P<0.05)，Vasohibin-2高表达组生存率显著低于低表达组P<0.05)，Vasohibin-2高表达组中位生存时间(540天)明显低于Vasohibin-2低表达组(720天)。这表明Vasohibin-2的表达水平与肝癌肝移植患者术后复发转移密切相关，并显著影响了预后。

目前我国常用的肝癌肝移植标准是上海标准和杭州标准，与国际米兰标准相比，它们在肿瘤的大小上明显放宽，但中国肝移植等记系统数据显示按上海和杭州标准的肝癌肝移植患者5年生存率与米兰标准相比无显著差异，说明一些肿瘤偏大的肝癌患者行肝移植仍可获得较好的预后。在临床实践中，我们发现存在一种特殊类型的肝细胞癌，直径大于5 cm，多有完整的包膜或有假包膜，呈膨胀性生长，侵袭和复发转移能力较低，生物学行为相对较好，患者预后也相对较好。研究者对其从分子病理，临床特征到预后等进行一系列的研究，证实了该类肝癌是一类具有特殊临床与分子病理特征，且肿瘤生物学行为相对较好的肝细胞癌[13]，如果上海标准和杭州标准将会把该类肝癌患者拒之门外，而从分子生物学水平研究肝细胞的侵袭转移能力将有助于建立符合我国国情的肝癌肝移植标准。

肝癌的恶性行为依赖于血管生成，包括肿瘤的生长和转移，TACE能提高晚期肝癌患者的生存，因此针对血管生成似乎是一种很有前途的针对肝癌的治疗方法[14]。在低氧条件下血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的与肿瘤相关的血管生成因子，抑制血管生成的药物索拉非尼已批准用于治疗肝细胞癌[15]。不幸的是，不到半数的晚期肝癌患者能从这些疗法中受益，而且作用往往是短暂的[16]。VASH2 高表达于骨髓起源的单核细胞中，它不依赖于VEGF的浓度调节且具有促进血管生成的作用[7]；试管中敲除Vasohibin-2不能明显抑制肿瘤细胞HEC50B的增殖，但能通过抑制血管生成抑制鼠移植瘤模型的生长，HEC50B的上层清液能促进人脐静脉内皮细胞的增殖，提示Vasohibin-2通过旁分泌的方式促进血管生成，从而促进子宫内膜癌的生长[8]。以上特点说明Vasohibin-2作为一个VEGF以外的血管抑制靶点的研究，将对肝癌肝移植术后复发转移机制及治疗策略研究有重要意义。

综上所述，Vasohibin-2上调参与了肝癌肝移植术后的复发转移，使其有可能成为预警肝癌肝移植术后复发转移的指标。Vasohibin-2作为促进血管生成的促癌基因为肝癌肝移植患者预防和治疗复发转移提供了新的途径。首次提出血管浸润相关基因作为肝癌肝移植选择标准之一，为建立符合我国国情的肝癌肝移植标准、合理应用肝源提供理论依据。

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(编辑：甘 艳)

Correlation between Expression of Vasohibin-2 and Recurrence/Metastasis and Prognosis of HCC Liver Transplant

LUO Laibang，YANG Hua，LUO Lifang，et al.

Jiangxi People’s Hospital，Nanchang，330006

Objective To analyze the expression of vasohibin-2 in HCC tissues and the correlation between its expression and clinical pathological characteristic as well as prognosis of HCC liver transplant.Methods Vasohibin-2 expression was determined in 34 HCC tissues and their PCLT by IHC(immunohistochemistry) and Western blotting.Follow-up study analyze the expression of vasohibin-2 in HCC tissue and the correlation between its expression and clinical pathological characteristic(numbers of tumor nodes、vien invasion、tumor cell differentiation and metastasis) as well as prognosis of HCC liver transplant.Results Vasohibin-2 located in the plasma of tumor cells.Vasohibin-2 positive expression ratio in HCC was higher than PLCT detected by IHC and Western blot，there were significant difference(P<0.05).The expression levels of vasohibin-2 protern on HCC tissues were higher than PCLT(196.6±31.4 VS 108.9±24.3)，there were significant difference(P<0.05).The higher expression of vasohibin-2 correlated with numbers of tumor nodes、vien invasion、tumor cell differentiation and metastasis(P<0.05).Follow-up study indicated that the recurrence ratio of high expression group was higher than low expression group(P<0.05)，the survival time of high expression group was shorter than low expression group(P<0.05).Conclusion Vasohibin-2 expression up regulated in HCC.High expression of vasohibin-2 attributed to recurrence/metastasis of HCC liver transplant.The determination of vasohibin-2 can be of great value in predicting the prognosis and recurrence/metastasis of patients with HCC liver transplant.

Vasohibin-2;HCC;Liver transplant;Recurrence/metastasis;Prognosis

江西省卫生计生委资助科技计划项目(编号：20155037)

330006 江西省人民医院

李新长

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.03.007

R735.7

A

1001-5930(2017)03-0370-05

2016-09-07

2016-11-05)